Uso de metodologia CRISPR/dCas9 para identificação de transferência gênica horizontal entre parasito e hospedeiro : aplicação na infecção por Trypanosoma cruzi

Abstract

A transferência gênica horizontal (TGH) tem um papel importante na plasticidade evolutiva dos organismos para novos ambientes e condições, podendo ser favorecida por diversas relações ecológicas, como o parasitismo. Exemplos convincentes de TGH têm sido demonstrados em diferentes parasitos e hospedeiros, como é o caso da transferência de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi para o genoma hospedeiro, preferencialmente em regiões de retroelementos LINE-1. Nesse sentido, várias metodologias são utilizadas para inferir a presença de TGH entre organismos não relacionados, cada uma com seu próprio conjunto de características e limitações. Recentemente, técnicas de marcação fluorescente passaram a ser empregadas para verificar a integração e localização de genes candidatos a TGH no genoma do hospedeiro. Assim, vários estudos já utilizaram o sistema CRISPR/dCas9 (Cas9 desativada), ligado a proteína verde fluorescente (GFP – Green Fluorescent Protein), para investigar a organização e dinâmica cromossômica e visualizar loci genômicos. Embora nenhum estudo ainda tenha utilizado a técnica para detectar eventos TGH, o sistema mostra-se promissor para tal, uma vez que possibilita avaliar a organização espaço-temporal dessas sequências no genoma. Neste trabalho, demonstramos a TGH na relação parasito-hospedeiro por metodologia CRISPR/dCas9, utilizando como modelo células infectadas pelo T. cruzi. Inicialmente, a técnica foi validada com diversos controles, o que mostrou especificidade de marcação e ausência de alvos inespecíficos. Nos grupos experimentais, células HEK-293 infectadas pelo parasito apresentaram pontos fluorescentes no núcleo, em diferentes períodos analisados, quando transfectadas com RNA guia (gRNA) para sequência de kDNA (gkDNA). Ainda, demonstramos que a transferência de kDNA independe da presença do parasito, uma vez que a transfecção com gkDNA detectou alvos no genoma de células tratadas com benznidazol e de células cocultivadas com o parasito em sistema transwell. Além disso, nossos dados mostram que a infecção pelo T. cruzi aumenta a expressão de retroelementos LINE-1. Em contraste, células transfectadas com gRNA para LINE-1 e posteriormente infectadas tiveram a expressão desses retroelementos reprimida em quase 80%. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que o sistema CRISPR/dCas9 foi capaz de identificar sequência de DNA proveniente de evento TGH no modelo de estudo. Os achados dão suporte ao uso da técnica como metodologia complementar na identificação e estudo de sequências transferidas horizontalmente entre diferentes organismos.