Método para detecção do RNA viral de SARS-CoV-2 empregando Ribozimas e DNA-hairpins associados em reação de hibridação em cadeia com transferência de energia fluorescente por ressonância

Abstract

A pandemia de COVID-19 teve seu início na província de Wuhan, situada na China, e foi causada pelo coronavírus SARS-CoV-2. Em poucos meses o vírus já tinha se espalhado pelo mundo todo, levando à uma grande preocupação de saúde pública global. Até o presente momento mais de 770 milhões de casos de infecção e mais de 6,9 milhões de óbitos em todo o mundo foram registrados. Esses elevados números de infecção demonstram a importância de métodos diagnósticos capazes de identificar a presença do vírus nos primeiros dias de infecção para direcionar políticas públicas de medidas de contenção evitando sua maior disseminação. Para essa fase inicial o método recomendado é o RT-qPCR, considerado padrão ouro atualmente. Entretanto, essa metodologia apresenta algumas limitações como elevado custo de produção, longo tempo de execução da técnica além da necessidade de mão de obra e equipamentos especializados. Além da necessidade de refrigeração no transporte e armazenamento que limitam sua ampla distribuição e utilização em vários ambientes, principalmente naqueles longe de centros urbanos que não possuem estrutura de saúde pública adequada. Portanto, este estudo tem como objetivo o desenvolvimento de um método diagnóstico sensível e de fácil manuseio, isento de atividade enzimática, de equipamentos e mão de obra especializados e refrigeração. Baseando-se em ribozimas para o reconhecimento e clivagem do RNA viral e moléculas meta-estáveis de grampos de DNA com fluoróforos em suas extremidades, capazes de realizar reação de hibridação em cadeia seguida por transferência ressonante de fluorescência (FRET-HCR) para a identificação do vírus. Os resultados indicaram que duas ribozimas projetadas conseguiram identificar e clivar o alvo transcrito in vitro de RNA viral e as moléculas de DNA hairpin foram eficientes nas reações de HCR e os fluoróforos nas reações de FRET, com os melhores resultados apresentando intensidade de fluorescência 1,34 ± 0,11 vezes superior ao controle negativo, evidenciando assim o potencial do método proposto. Portanto, este estudo serviu como prova de conceito para o uso conjunto de ribozimas e grampos de DNA com fluoróforos em reações FRET-HCR para detectar SARS-CoV-2.