Efeito da proteína citosólica ligante de triiodotironina (p38CTBP) na regulação da transcrição mediada por T3 e suas interações com proteínas nucleares

Abstract

Introdução: A importância das proteínas citoplasmática na captação, estoque e translocação nuclear dos hormônios tireoideanos ainda é pouco conhecida. Além do mais, a relação da proteína citosólica ligante de T3 de 38kDa (p38CTBP ou simplesmente CTBP) com transporte nuclear de T3 e transcrição gênica T3 mediada é ainda controversa. O objetivo deste estudo foi investigar a função da CTBP na ativação do receptor de hormônio tireoideano (TR) mediada por T3. Métodos: Curvas dose resposta de T3 foram realizadas em células CHO co-transfectadas com os plasmídeos expressando TRβ1, CTBP ou o gene da enzima luciferase controlado pelo promotor do TRH e elementos responsivos ao hormônio tireoideano (DR4, F2, PAL). Ensaios de transporte celular total e nuclear foram realizados em células CHO transfectadas ou não com CTBP. Uma vez que a CTBP pode estar localizada no núcleo, nós também medimos as interações da CTBP com TR e proteínas co-reguladoras tais como SMRT, SRC1. Resultados: A hiper-expressão de CTBP aumentou a captação de [125I]T3, 61,6±9,4 cpm/μg de proteína em células controle para 151,6±23,7 cpm/μg de proteína (p<0,05). Em ensaios de gene repórter, a co-tranfecção de CTBP aumentou a ativação máxima do TR no TRE- PAL em 42%. Além disso, a alta expressão de CTBP em células CHO aumentou o EC50 do T3 no TRE-DR4 em 5,5 vezes. Por outro lado, no TRE-F2 e promotor do TRH, um gene regulado negativamente pelo T3, a co-transfecção da CTBP não alterou a ativação ou repressão mediada por T3, respectivamente. De modo interessante, os ensaios de GST pull-down mostraram que a CTBP interagiu diretamente in vitro com GST-TRβ1 e GST-SMRT, mas não com GST-SRC1 Conclusão: Foi demonstrado neste trabalho que a CTBP aumentou as concentrações intracelulares de T3 e modulou a transcrição gênica mediada por T3 de um modo TRE-específico. Interessantemente, a CTBP interagiu diretamente com TRβ1 e com o co-repressor SMRT, mas não com SCR1. Numa análise geral, estes resultados sugerem que a CTBP pode afetar a ação do T3 não somente alterando níveis intracelulares de T3, mas também interagindo com proteínas nucleares envolvidas na resposta ao T3. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Background: The importance of the cytoplasmatic proteins in the uptake, storage and nuclear translocation of thyroid hormone is poorly understood. Moreover, the relation of cytosolic thyroid binding protein 38kDa (p38CTBP or simply CTBP) with nuclear transport of T3 and T3-mediated gene transcription is still controversial. The aim of this work was to investigate the role of CTBP in the T3-mediated thyroid receptor (TR) activation. Methods: T3 dose response curves were performed in CHO cells cotransfected with plasmids expressing TRβ1, CTBP, and thyroid responsive elements driving the luciferase gene (TREs – DR4, F2, PAL and TRH promoter). Whole cell and nuclear [125I]T3 transport assays were performed in CHO cells transfected or not with CTBP. Since CTBP could be localizated in the nucleus, we also measured the interactions of CTBP with TR and coregulator proteins such as SMRT, SRC1 through GST-pull down assays. Results: Overexpression of CTBP increased [125I]T3 uptake from 61.6±9.4 cpm/μg protein in control cells to 151.6±23.7 cpm/μg protein (p<0.05). In reporter gene assays, CTBP cotransfection increased TR maximum activation on TRE-PAL by 42%. Additionally CTBP overexpression in CHO cells increased T3 EC50 on TRE-DR4 by 5.5 fold. On the other hand, on the TRE-F2 and TRH promoter, a T3 negatively regulated gene, the co-transfection of CTPB did not change T3 activation and repression, respectively. Interesting, GST pull-down assays showed that CTBP directly interacted in vitro with GST-TRβ1 and GST-SMRT, but not GST-SRC1. Conclusion: We demonstrated that CTBP increases intracellular T3 concentration and modulates T3-mediated gene transcription and this effect is TRE specific. Furthermore, CTBP directly interacted with TRβ1 and the corepressor SMRT, but not with coactivator GRIP1. Taken together, these results suggest that CTBP may affect T3 action not only by changing T3 intracellular levels, but also interacting with proteins involved in T3 response.