Obtenção de matriz extracelular descelularizada de córtex ovariano bovino e sua caracterização

Abstract

A descelularização da matriz extracelular (MEC) de tecido ovariano está sendo investigada como uma possibilidade de desenvolvimento de um ovário artificial transplantável (OAT), uma alternativa que surge para preservar a fertilidade em mulheres diagnosticadas com câncer, que poderiam se tornar inférteis devido à quimioterapia e/ou radioterapia. Os métodos existentes de obtenção de MEC descelularizada (dMEC) do tecido ovariano não foram otimizados e só alcançaram sucesso em camundongos. Os objetivos do presente estudo foram (1) obter uma dMEC de tecido ovariano de bovino usando a menor concentração de docedil sulfato de dódio (SDS) e o menor tempo de incubação que garantam a descelularização; e (2) analisar a proteômica da MEC antes e depois da descelularização. Para a obtenção da dMEC de córtex ovariano bovino, foram testadas as concentrações de SDS e NaOH de 1% e 0,2M, 0,5% e 0,1M, 0,1% e 0,02M, e 0,05% e 0,01%, com tempos de incubação de 24h, 12h e 6h. O tecido obtido de cada tratamento foi analisado por histologia, eletroforese e quantificação do DNA para verificar a descelularização. A análise histológica confirmou a descelularização, e a coloração com tricrômico de Mallory mostrou a conservação das fibras de colágeno em todas as amostras após cada tratamento. Além disso, a menor concentração de SDS que não mostrou DNA remanescente na análise de eletroforese foi de 0,1%, quando incubado por 24h e 12h. A quantificação do DNA resultou em < 0.2 ng DNA/mg de tecido ovariano utilizando estes protocolos. Ademais, a viabilidade celular mostrou que a dMEC (obtida por 0,1% de SDS e 0,02M NaOH por 12h) não era tóxico para as células ovarianas humanas durante o cultivo in vitro por até 72h. Por meio de análise proteômica foram identificadas 155 proteínas do matrisome MEC nativa do córtex ovariano bovino, e 145 na dMEC. Após a descelularização, apenas 10 proteínas do matrisome foram perdidas, e nenhuma delas pertencia à categoria de processos biológicos reprodutivos. Também, demonstramos que o colágeno tipo VI alfa 3 e heparan sulfate proteoglycan 2 foram os componentes mais abundantes da MEC ovariana bovina. As análises bioinformáticas mostraram que as proteínas, tanto da MEC nativa como da dMEC, apresentam funções que se enquadram em 12 processos biológicos, 19 componentes celulares e 13 funções moleculares. Os resultados obtidos neste trabalho podem contribuir para a compreensão das funções desempenhadas pelas proteínas da MEC ovariana nos processos de ovogênese, foliculogênese e esteroidogênese. Além disso, as proteínas identificadas da MEC podem servir como base de novos materiais para um OAT.