Desenvolvimento de um teste de ELISA para a Covid-19 com a proteína do nucleocapsídeo do SARS-CoV-2

Abstract

A COVID-19 (do inglês coronavirus disease 2019), é uma doença cuja forma severa é caracterizada pela Síndrome Respiratória Aguda Grave, é causada pelo novo betacoronavírus SARS-CoV-2 (do inglês Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2). Desde o relato do primeiro caso na cidade de Wuhan, província de Hubei, China, em dezembro de 2019, o SARSCoV-2 se espalhado rapidamente pelo mundo. No dia 30 de janeiro de 2020, a Organização Mundial de Saúde (OMS) classificou a doença como uma emergência de saúde internacional e no dia 11 de março declarou haver uma pandemia (OMS,2020). A atual pandemia da COVID- 19, vem exigindo o desenvolvimento de vários produtos e serviços biotecnológicos para detecção, tratamento e prevenção de infecções e doenças causadas por esse vírus. Além das ferramentas moleculares para detecção desse vírus, como a reação em cadeia da polimerase quantitativa com transcriptase reversa (RT-qPCR), técnicas sorológicas foram desenvolvidos e têm sido bastante empregadas para avaliar a soroconversão de pacientes infectados e imunizados. Neste trabalho nosso objetivo visou desenvolver um teste sorológico (ELISA-protótipo in-house) para detecção de anticorpos IgG anti-proteína N do SARS-COV-2 circulantes em pacientes atendidos no Hospital Regional de Santa Maria-DF, Brasil. Tendo como ferramenta molecular utilizamos proteínas recombinantes produzidas com a utilização do sistema baculovírus/célula de inseto para expressão heteróloga utilizamos a expressão da proteína nucleocapsídeo (N) de SARS-CoV-2 em células de insetos, seguida de sua purificação por cromatografia de afinidade. O gene N foi clonado no genoma do Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) via transposição e o baculovírus recombinante resultante foi usado para infecção de células de lepidópteros (Sf9) adaptadas à suspensão de alta densidade. O antígeno foi testado em amostras obtidas de pacientes confirmados para COVID-19 por RT-qPCR do Hospital Regional de Santa Maria –DF e aplicado em um modelo de ELISA indireto – in house. O ELISA indireto in-house pode ser usado como ferramenta para o detecção de IgG de forma quantitativa. Após validação do protótipo às análises auferidas mostraram que a proteína N, tem potencial imunogênico, e que o protótipo ELISA – in-house, pode ser uma ferramenta utilizada no diagnóstico da COVID-19, tendo em vista os dados alcançados na análise estatística, onde apresentaram uma sensibilidade de 94,4%, especificidade de 92,1% e acurácia de 92,5% nas amostras com desconto das reações de fundo (reações inespecíficas), utilizando-se da curva ROC e com intervalo de confiança de 95% (IC95%) nos paciente que apresentaram sintomas inferiores a sete dias da infecção. As amostras com intervalo >7 a 14 dias, alcançaram a sensibilidade de 100% e a especificidade de 94,4% utilizando-se da curva ROC. Outro fator observado, indica que as análises sem o desconto das reações de branco (reações inespecíficas) diminuem a sensibilidade e especificidade em ambas as análises (NBD e NBF).