Caracterização bioquímica e análise estrutural in silico de Thimet Oligopeptidase de Trypanosoma cruzi

Abstract

A Doença de Chagas é uma doença negligenciada causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, que é transmitido principalmente através da picada do inseto barbeiro e da ingestão de alimentos contaminados, atingindo de 6 a 7 milhões de pessoas no mundo. A doença é caracterizada por causar sintomas agudos leves, mas em cerca de 30% dos casos evolui para a fase crônica com acometimento de órgãos como o coração e o intestino. Até o momento, não existe vacina e o tratamento baseia-se em dois medicamentos de pouca eficácia sobretudo na fase crônica da doença. O desenvolvimento de alternativas quimioterápicas menos tóxicas requer a busca por moléculas-alvo vitais para o protozoário que possam ser inibidas de maneira específica, como as enzimas. A thimet oligopeptidase (TOP) é uma metaloprotease dependente de zinco pertencente à família M3 que tem como principal substrato a bradicinina, peptídeo vasoativo que aumenta a permeabilidade vascular. Em humanos, a TOP é uma das principais processadoras intracelulares de oligopeptídeos, atuando na seleção de antígenos apresentados pelo MHC-I em casos de infecção viral e câncer, por exemplo. Devido à escassez de informações acerca da TOP em protozoários, pouco ou quase nada se sabe sobre o papel da TOP de T. cruzi (TOPTc). Diversos estudos apontam a sua presença em secretomas ou na superfície do parasito em diferentes fases do seu ciclo de vida, indicando uma possível e provável interação direta com a célula hospedeira. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi expressar a TOPTc recombinante em E. coli, realizar sua caracterização bioquímica e elaborar uma análise estrutural por meio de modelagem molecular. Dentre os principais resultados, foi observado que a enzima foi ativa sobre o substrato Mca-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Lys(Dnp) com Km de 24,89 µM em 50 mM de tampão fosfato pH 7.0 como tampão ótimo de atividade. A atividade da TOPTc é dependente de zinco, apresenta termofilicidade e sua inibição não é afetada por EDTA, porém é inibida por Cpp-Ala-Ala-Phe-pAb com IC50 de 54,29 nM. Dentre os modelos 3D gerados, o obtido pelo Alphafold apresentou melhores parâmetros tais quais menor MolProbity score e maior Ramachandran Favored score. Por fim, anticorpos específicos produzidos contra a enzima, mostraram uma marcação próxima a bolsa flagelar do parasito, local de intensa troca de moléculas com o meio extracelular. Esse trabalho representa o primeiro estudo de TOP de protozoários, com a caracterização de parâmetros bioquímicos, de localização e de estrutura, que contribuirá especialmente para a busca de inibidores capazes de romper o ciclo de vida do parasito, visando um futuro tratamento para a doença de Chagas.