Imunocitoquímica e hibridização in situ na microscopia eletrônica : metodologia complementar na caracterização de vírus e viróides

Abstract

A virologia foi, provavelmente, um dos campos que mais se beneficiou com a introdução do microscópio eletrônico como ferramenta de pesquisa. A microscopia eletrônica desempenha um importante papel na caracterização dos vírus, fornecendo dados sobre a morfologia das partículas e citopatologia. Estes dados podem contribuir para complementar a caracterização viral e consolidar a taxonomia dos mesmos, além de ser um importante auxiliar na diagnose da doença. Estes benefícios da microscopia eletrônica se estendem naturalmente à virologia vegetal. Tecidos de plantas infectados por vírus, quando observados ao microscópio eletrônico, podem apresentar efeitos citopáticos típicos que geralmente incluem o aparecimento dos corpúsculos de inclusão. Estas inclusões podem ser formadas por partículas virais ou estruturas induzidas pela infecção viral, presentes no citoplasma ou núcleo das células infectadas. No citoplasma, estas inclusões podem estar representadas por partículas virais, proteínas não estruturais ou alterações celulares, ou mesmo uma mescla de todos eles. No núcleo, as inclusões podem estar relacionadas com o nucléolo, presentes no nucleoplasma ou espaço perinuclear. Contudo, diversas são as limitações das técnicas convencionais e histologia ultraestrutural para se identificar de forma inequívoca os virions, a natureza de certas inclusões ou mesmo a localização de ácidos nucleicos envolvidos no processo da infecção viral. Diante destes aspectos, técnicas auxiliares como a imunocitoquímica e a hibridização in situ muitas vezes podem ser capazes de solucionar estes problemas. A imunocitoquímica tem por finalidade localizar proteínas através da identificação de sítios onde se dá a reação antígeno-anticorpo e sua visualização através de um marcador - o ouro coloidal. Já a hibridização in situ, consiste no fenômeno do pareamento de bases entre dois ácidos nucleicos complementares, um dos quais se acha marcado e funciona como sonda molecular. Este trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo básico para imunocitoquímica e hibridização in situ de vírus e viróides de plantas, respectivamente em nossas condições. Os resultados de ensaios imunocitoquímicos com vírus pertencentes aos grupos tospovirus, potyvirus, rhabdovirus, ilarvirus, tobravirus, tymovirus e potexvirus permitiram a detecção dos antígenos de proteínas estruturais e não estruturais destes vírus demonstrando a consistência do método. A detecção de ácidos nucleicos pela hibridização in situ permitiu a localização de RNAs do "avocado sunblotch viroid ’-ASBVd nos cloroplastos indicando a probabilidade de ser este o sítio de replicação deste viróide .