Estudo funcional da prolil oligopeptidase de Trypanosoma cruzi e Leishmania infantum : nocaute gênico, inibição enzimática e processos infectivos

Abstract

A prolil oligopeptidase (POP) é uma serino protease que cliva peptídeos de até 30 aminoácidos, porém já foi observada sua capacidade de hidrólise de colágeno, fibronectina e componentes da matriz extracelular. Participa de importantes processos biológicos e está envolvida em diversas doenças neurológicas e inflamatórias. Estudo recentes apontaram a POP de Trypanosoma cruzi (POPTc80) como importante alvo contra a doença de Chagas por meio do desenvolvimento de vacina contra a proteína. Este trabalho teve como objetivo analisar o envolvimento da POP na patogenia de duas doenças: a doença de Chagas e a Leishmaniose visceral. A prolil oligopeptidase de T. cruzi (POPTc80) foi analisada por meio de nocaute físico do gene POPTC80 com a deleção do alelo Non-esmeraldo like pela integração do cassete contendo o gene NEO, que confere resistência a geneticina (G418), sendo observado diferenças de expressão da proteína tanto entre os diferentes clones quanto comparado a cultura selvagem. O clone B2 apresentou uma divisão celular a cada 47 h e o clone C6 a cada 52h, e a imuno marcação mostrou uma redução na intensidade do sinal de fluorescência. O nocaute do alelo Esmeraldo-like para realizar o duplo nocaute, foi com reparo por homologia direta (RHD) e inserção do cassete que confere resistência a marca de seleção higromicina. O duplo nocaute (poptc80-/-) foi confirmado pela amplificação do gene higromicina fosfotransferase e corroborado pela imunofluorescência (IF) com ausência de marcação da POPTc80 nos parasitos. A POP de L. infantum (POPLi) foi avaliada quanto a sua capacidade infectiva em macrófagos murinos sob presença de inibidores específicos da POP, S 17092 e Z-Pro-Prolinal, indicando 50% de redução da taxa de infecção, o que também foi observado quando os parasitos foram incubados com a proteína recombinante e o anticorpo. A POPLi foi observada expressa na fração de membrana e citoplasmática do parasito e este resultado foi corroborado pelo ensaio de IF. A análise funcional da POP de T. cruzi e L. infantum, nos permite avançar na busca por novos alvos quimioterápicos para o tratamento de ambas as doenças tropicais negligenciadas.