Variantes de Inibidores de a-amilases selecionados por Phage Display com atividade para a-amilases do Bicudo do Algodoeiro (Anthonomus grandis, Coleptera: Curculionidae)

Abstract

O bicudo do algodoeiro (Ânthonomus grandis) é uma das principais pragas da cultura do algodão, ocasionando perdas significativas devido ao hábito endofítico das larvas, cujos botões florais e as maçãs do algodoeiro são os órgãos preferencialmente atacados pelos insetos, tanto para alimentação, quanto para oviposição, dificultando seu controle pelo uso de inseticidas. Entre as proteínas vegetais relacionadas aos mecanismos de defesa das plantas, os inibidores de a-amilases são conhecidos por suas distintas especificidades para insetos-praga. O bicudo utiliza a-amilases intestinais para digerir o amido presente nas partes das plantas ingeridas. O presente trabalho teve por objetivo selecionar variantes de inibidores de a-amilase (a-AI) com afinidade para aamilases do bicudo do algodoeiro, a partir de uma biblioteca combinatória de genes codificadores para mutantes de inibidores de a-amilase, obtidos por meio da recombinação entre os inibidores a-A ll e a-AI2, isolados de sementes de feijão (Phaseolus vulgaris). Para isto, a-amilases do bicudo do algodoeiro (AGA) foram parcialmente purificadas e utilizadas em experimentos de biopanning. Além disso, uma a-amilase do inseto, AgamyYl foi expressa em levedura Pichia pastoris e utilizada para análise da atividade dos variantes selecionados. Foi possível selecionar vinte e seis variantes com afinidade para AGA apresentando distintas mutações herdadas dos genes parentais. Cinco variantes selecionados para AGA foram utilizados para transformação de Arabidopsis thaliana que foi capaz de expressar os a-AIs na forma ativa. Estes variantes foram capazes de inibir a atividade amilásica de AGA in vitro. As estratégias de DNA shuffling e Phage Display foram eficientes para a seleção de inibidores para aamilases do bicudo do algodoeiro, disponibilizando novos genes com potencial para o controle do bicudo. Após a análise da toxicidade in vivo estes inibidores poderão ser utilizados em programas de melhoramento vegetal utilizando transgenia.