Proteína multiepitopo recombinante para o desenvolvimento de kit de diagnóstico para hepatite C

Abstract

O vírus da hepatite C (HCV) é um importante patógeno humano afetando 3% da população humana. A infecção crônica é frequente sendo uma das principais causas de cirrose hepática e carcinoma hepatocelular. Estudos de soroprevalência indicam que pelo menos 200 milhões de pessoas tenham sido infectadas no mundo sendo que somente no Brasil aproximadamente 2 milhões de casos foram relatados até 2003. Vários kits de diagnóstico baseados EIA (Enzyme immunoassay) estão disponíveis no mercado para a detecção de anticorpos anti-HCV no plasma. No entanto, devido à distribuição geográfica distinta de todos os genótipos do HCV no mundo, estes kits nem sempre apresentam um bom desempenho nas diferentes localidades do mundo. Atualmente, esses kits utilizam antígenos peptídicos (kits de terceira geração) ou antígenos recombinantes (kits de quarta geração) de ambas as regiões, estruturais e não estruturais, da proteína viral. A exigência de múltiplos peptídeos e/ou múltiplas proteínas recombinantes para o diagnóstico confiável de infecção pelo HCV aumenta o custo destes kits. A fim de reduzir o custo de fabricação e aumentar a especificidade dos kits de detecção de HCV desenvolvemos uma cadeia única de proteína multiepitopo recombinante composta de várias partes das regiões estruturais e não estruturais da proteína viral. Este gene sintético, com 948 pb, e que codifica para uma proteína multiepitopo HCV (denominado r-MEHCV) foi clonado no vetor pET21a. Células de Escherichia coli BL21 (λDE3) foram transformadas com o plasmídeo resultante e a expressão induzida com 1 mM IPTG. Após 8 h de indução, uma proteína com massa molecular aparente de ~37 kDa foi observada. A proteína recombinante foi purificada até homogeneidade por meio de uma única etapa por cromatografia de afinidade com resina Ni-NTA. A expressão bem-sucedida, assim como os ensaios realizados com a construção de um ELISA “caseiro” baseado na r-MEHCV, no quais amostras de soros reagentes e não reagentes para HCV e reagentes para outras patologias foram analisadas, mostraram que esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de um autêntico kit brasileiro para fins de diagnóstico da hepatite C. Análises de dicroísmo circular em pH 7 e 8 mostraram que essa proteína apresenta um padrão de dobramento compatível com estruturas secundária e terciária.