Isolamento e caracterização de promotores de genes induzíveis em resposta a estresses biótico e abiótico

Abstract

A biotecnologia vegetal têm alcançado progressos através do uso da engenharia genética como uma aliada na geração de organismos geneticamente modificados. Contudo, o sucesso da tecnologia de transformação genética de plantas, desde a pesquisa básica até o desenvolvimento de novas cultivares está diretamente associado à obtenção de um nível de expressão apropriado do DNA exógeno, que depende da correta seleção do promotor a ser utilizado. Assim, a busca por promotores induzíveis têm sido uma poderosa estratégia biotecnológica para controlar a expressão de genes envolvidos em respostas a estresses bióticos e abióticos. No primeiro capítulo deste estudo foi descrito o isolamento de três promotores de genes de algodão (Gossypium hirsutum) induzidos pelo estresse biótico causado pelo desenvolvimento da larva do bicudo-do-algodoeiro em botões florais de plantas de algodão. Inicialmente, foram selecionados 20 genes com padrão de expressão induzível identificados no transcriptoma de botões florais de algodão infestados com larvas do bicudo. A expressão desses genes foi analisada por RT-qPCR após diferentes tempos de alimentação da larva do bicudo. Botões florais de algodão inoculados com um ovo do bicudo-do-algodoeiro, contendo um embrião ativo, foram analisados após 2h, 6h, 12h, 24h e 96h de inoculação. Entre os genes analisados, GhERF17-like, GhERF105-like e GhNc-HARBI1 apresentaram um perfil de expressão aumentado, principalmente em respostas tardias (12h, 24h e 96h). Essas análises confirmaram que estes genes são induzíveis pelo estresse biótico causado pelo desenvolvimento da larva do bicudo-do-algodoeiro em botões florais de plantas de algodão. As sequências dos promotores desses três genes foram isoladas e analisadas quanto à presença de elementos cis regulatórios e foram identificados, nos três promotores, elementos cis do tipo ERF, MYB e muitos fatores de transcrição W-box (conhecidos como local de ligação do fator de transcrição do tipo WRKY): WRKY71OS, WBOXNTERF3, WBBOXPCWRKY1, WBOXATNPR1. Além disso, também foram identifidas sequências cis- regulatórias envolvidas na indução de ácido salicílico (SA). Posteriormente, esses três promotores foram clonados no vetor de expressão estável que contém a fusão GUS-GFP. A atividade do gene repórter GFP, controlada pelos promotores pGhERF17-like, pGhERF105-like e pGhNc-HARBI1-like, foi monitorada e comparados com o promotor CaMV35S em folhas de plantas transgênicas de A. thaliana sob estímulo com ácido salicílico (AS). As análises indicaram que os três promotores foram induzíveis pelo AS, com destaque para o promotor pGhNc- HARBI1-like cuja fluorescência de GFP foi mais intensa, quando submetida ao tratamento com AS, enquanto nenhuma fluorescência foi observada no tratamento controle. Já em plantas com o promotor CaMV35S observou-se intensa fluorescência com e sem o tratamento com AS. Estudos adicionais estão sendo realizados para proporcionar uma cacterização completa desses três promotores que, possivelmente, poderão ser indicados como potenciais ferramentas biotecnológicas para impulsionar a expressão gênica induzível em plantas. No segundo capítulo o objetivo foi identificar e caracterizar o promotor GmRD26 (pGmRD26), que está envolvido na regulação das respostas das plantas ao estresse hídrico. O perfil de expressão do gene GmRD26 obtido por qRT-PCR sob condições de estresse e sem estresse confirmou que o GmRD26 é induzido sob condições de déficit hídrico. A caracterização da região promotora GmRD26 foi realizada sob condições de estresse com ácido abscísico (ABA), polietilenoglicol (PEG) e seca em plantas de A. thaliana contendo a construção completa de pGmRD26::GUS (2.054 pb) e dois módulos, pGmRD26A::GUS (909 pb) e pGmRD26B::GUS (435 pb), controlando a express do gene β-glucuronidase (uidA). Os módulos pGmRD26 e pGmRD26A conferiram expressão forte e induzida de transgenes. Os dados demonstraram que, de acordo com análises da atividade de GUS, o pGmRD26A induziu maior expressão de transgenes do que o promotor usado como controle positivo, AtRD29, e que os outros módulos, dependendo do tipo de tratamento analisado. O módulo pGmRD26A forneceu maior capacidade de transcrição do gene uidA do que outros módulos, especialmente em resposta a tratamentos com polietilenoglicol e seca. Em resumo, este estudo indica que o pGmRD26A pode se tornar uma ferramenta biotecnológica promissora para aplicação no desenvolvimento de plantas modificadas tolerantes à seca ou outras plantas projetadas para resposta ao estresse.