Análise do transcriptoma e da expressão diferencial de genes de micélio e levedura de Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

Paracoccidioides brasiliensis, um fungo dimórfico, termo-regulado, é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica de alta prevalência na América Latina. Presume-se que a sua patogenicidade seja uma conseqüência do processo de diferenciação celular, da forma de micélio para a de levedura, que ocorre neste fungo durante a infecção humana. O presente trabalho iniciou-se com o Projeto Genoma Funcional e Diferencial do P. brasiliensis, no qual foram seqüenciadas 25.597 Expressed Sequence Tags (ESTs). Destas, 19.718 ESTs possuíam PHRED 20 e foram agrupadas em 6.022 grupos (genes), dos quais 2,655 eram contigs (grupos com mais de uma EST) e 3,367 eram singlets (grupos com apenas uma EST). Os 6,022 grupos representam aproximadamente 80% do genoma estimado deste fungo. Estes genes foram anotados e categorizados funcionalmente (MIPS) de acordo com o processo celular no qual estavam envolvidos: virulência (28 genes), genes potencialmente envolvidos em alvos para drogas (17 genes), vias de transdução sinal (37 genes), transportadores tipo MDR (multidrugs resistence) (20 genes), genes de choque térmico (48 genes) e estresse oxidativo (23 genes), entre outros. Genes diferencialmente expressos em células de micélio e levedura foram identificados usando duas metodologias de análises da expressão gênica em larga escala: subtração in silico e microarranjos de cDNA. A subtração in silico foi baseada no cálculo do número de ESTs de micélio e de levedura em cada contig. Contigs formados por 100% da mesma forma ou por um número maior de ESTs em uma das fases foram considerados diferencialmente expressos. Esta análise indicou 417 genes diferencialmente expressos, sendo 178 de micélio e 239 de levedura. Para os microarranjos de cDNA, 1.152 genes foram selecionados, sendo 565 contigs formados por 6 ou mais ESTs de micélio e levedura, 39 contigs formados por 2, 3, 4 ou 5 ESTs exclusivos de micélio ou levedura e 548 singlets que apresentavam anotação funcional. Nos microarranjos, os fragmentos de cDNA foram amplificados por PCR e hibridados com RNA total das duas formas. Destes genes, 328 mostraram-se diferencialmente expressos, sendo 58 de micélio e 270 de levedura. Estas duas estratégias identificaram 110 genes diferencialmente expressos em micélio e levedura. Dentre estes, foram selecionados para análise os genes classificados em três categorias MIPS. Na categoria metabolismo, foram selecionados 12 genes, sendo 5 (icdh, scs, tal, adk, udk) mais expressos em micélio e 7 (icl, acylcs, pdh, adh, papsr, aca, amt) mais expressos em levedura. Na categoria metabolismo e transporte de íons, foram selecionados 5 genes, sendo 2 (chs, ats) da via de síntese de novo de cisteína do metabolismo de enxofre e 3 (isc, ktp, pct) envolvidos no transporte de íons. Na categoria controle e organização celular - parede celular, membrana e citoesqueleto, foram selecionados 5 genes: ags, pcd, vrp bgl e hex. O caráter diferencial de todos estes genes foi confirmado por experimentos de northern blot. Estas análises mostraram que: células de micélio apresentam uma tendência para o metabolismo aeróbico enquanto um metabolismo anaeróbico é sugerido para as células de levedura; a super expressão em levedura dos genes que codificam as enzimas ATP sulfurilase, APS quinase, PAPS redutase e coline sulfatase, pertencentes ao metabolismo de enxofre, mostram a importância do enxofre orgânico para os processos de crescimento e diferenciação deste patógeno; a expressão diferencial de genes envolvidos na organização celular é essenciais para o processo de diferenciação celular, virulência e conseqüentemente patogenicidade de P. brasiliensis. Neste contexto, o conjunto das informações geradas neste trabalho fornece novos caminhos para o entendimento da transição dimórfica do P. brasiliensis, bem como identifica novos genes importantes para a virulência/patogenicidade deste fungo, que constituem potenciais alvos para o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas.