Caracterização bioquímica e biofísica de uma β-glicosidase obtida do metagenoma de intestino de Syntermes wheeleri

Abstract

As celulases são enzimas da família Glicosil hidrolases (GHs) que estão envolvidas na degradação da celulose e participam em diversas aplicações biotecnológicas. Neste estudo foram selecionadas sequências metagenômicas do intestino de Syntermes wheeleri, um cupim endêmico do Cerrado brasileiro, para seleção, purificação e caracterização de uma celulase. Entre as sequências selecionadas e produzidas em Escherichia coli (DE3) foi escolhida apenas uma para o trabalho, uma β-glicosidase GH3 (β-G 72-26) que apresentou melhor produção em relação às outras (β-1,4-endoglucanase e exoglucanase). A β-G 72-26 foi purificada por cromatografia de exclusão molecular, apresentando tamanho aproximado de 89,7 KDa em gel SDS-PAGE 12%. A enzima foi caracterizada quanto ao pH e temperatura ótimo, quando pode-se observar duas faixas de pH ótimo, pH 7,0 e 10,0, e uma temperatura ótima de 40 ºC. Por meio dos parâmetros cinéticos pode-se constatar melhor atividade enzimática em pH básico, contudo melhor afinidade (Km) pelo substrato pNPG em pH neutro. Além disso, em pH neutro a β-G 72-26 apresentou melhor eficiência catalítica (Kcat/Km). Os resultados de dicroísmo circular mostraram que a estrutura secundária da enzima é dependente de pH, com porcentagens diferentes de estruturas alfa hélice e folhas beta, apresentando-se mais estruturada em pH 10,0. Já nos resultados de termoestabilidade pode-se observar a desnaturação da β-G 72-26 em ambos os pHs, menos em pH ácido (4,0). Ainda como análise estrutural, a β-glicosidase em estudo foi alinhada com sequências estruturadas do PDB (Protein Data Bank) para análises de domínios e sítios catalíticos conservados, quando constatou-se a presença de 3 domínios: (1) (α/β)8-barril (TIM barril), (2) (α/β)6 folha (β-sanduíche) e (3) Fibronectina iii, com função ainda desconhecida. Os sítios catalíticos conservados foram os Asp233 e Glu417. Por meio dos resultados obtidos a β-G 72-26 mostra-se uma candidata a ensaios de aplicação industrial, além de contribuir para a caracterização de uma nova β-glicosidase GH3, a qual pertence a um cupim endêmico no Cerrado brasileiro.