Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador

Abstract

Quimosina é uma aspartil protease que catalisa a reação de hidrólise da κ-caseína, provocando a coagulação do leite. Esta enzima é amplamente utilizada na indústria queijeira, devido à sua especificidade e baixa atividade proteolítica, o que confere características organolépticas desejáveis e alto rendimento a produção de queijo. Neste trabalho, a quimosina bovina B foi produzida em K. phaffii e purificada. Para obtenção das linhagens contendo múltiplas cópias do gene da quimosina foram utilizados vetores integrativos com o gene CHYM sob o controle do promotor do gene PGK1 e a marca de seleção auxotrófica leu2-d. O cassete de expressão é flanqueado por sequencias de homologia a três loci genômicos: PGK1, 5S rDNA e uma sequências repetitiva do cromossomo 3. Clones selecionados de cada construção foram analisados quanto ao número de cópias, estabilidade genética e produção enzimática em frascos utilizando meios de cultura distintos. Os clones P33 (integração no lócus PGK1), R5 (integração no lócus 5S rDNA) e C32 (integração em uma sequência repetitiva do cromossomo 3) apresentam 20, 23 e 2 cópias respectivamente e todos se mostraram instáveis em meio de cultivo não seletivo. O maior valor de atividade enzimática foi obtido em meio YPD para clone C32 (183 UAC.mL-1). A quimosina recombinante foi purificada por cromatografia de gel filtração e analisada por SDS-PAGE. Foram encontradas duas formas da quimosina recombinante, uma com massa molecular de ~36 kDa, correspondente à enzima ativa e uma com massa molecular maior que corresponde a enzima glicosilada.