Caracterização e análise da expressão de microRNAs-like de Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

Fungos do gênero Paracoccidioides compreendem os agentes etiológicos da Paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais prevalente na América latina. Estes patógenos apresentam como característica o dimorfismo térmico. Em temperaturas entre 22ºC à 26ºC Paracoccidioides spp. crescem como micélio; já no hospedeiro à 36ºC estes fungos apresentam-se como levedura. A transição morfológica da fase de micélio ou conídios para levedura é essencial para o desenvolvimento da doença no hospedeiro. Em vários fungos, pequenos RNAs regulatórios denominados microRNAs-like tem sido descritos durante as diferentes fases morfológicas, sugerindo um possível papel regulatório em etapas essenciais para o desenvolvimento fúngico no ambiente e no hospedeiro. Desta forma o presente trabalho tem como objetivos a descrição in silico das proteínas envolvidas na via de silenciamento gênico pós-transcricional mediado por microRNAs-like em Paracoccidioides spp., a identificação in silico de microRNAs-like no genoma deste fungo e a caracterização dessa classe de RNAs presentes nas diferentes fases e na transição dimórfica através de RNAseq, além da categorização dos possíveis processos biológicos regulados por microRNAs-like. Análises in silico revelaram a presença de proteínas homólogas a dicers e argonautas em P. brasiliensis (Pb18 e Pb03) e P. lutzii. Além disso, os transcritos que codificam para estas proteínas são induzidos na fase parasitaria. Através de ferramentas de bioinformática, baseado em similaridade de sequências detectou-se 18 potencias microRNAs-like conservados no genoma deste fungo e destes 5 microRNAs-like com os maiores e menores valores de MFE foram validados por PCR qualitativa, demonstrando assim que este patógeno retém em seu genoma regiões de gênese de microRNAs-like. Posteriormente a esta etapa, os transcritos que codificam para dicers e argonautas foram analisados em estádios morfológicos de P. brasiliensis Pb18, através de qRT-PCR. Os dados de expressão gênica relevaram que a maquinaria de silenciamento mediado por microRNAs-like é diferencialmente expressa entre os estádios morfológicos deste fungo. Os dados do sequenciamento das bibliotecas de pequenos RNAs nas fases de micélio, transição e levedura, permitiram a identificação de 48 microRNAs-like e deste 44 foram diferencialmente expressos. Análises dos microRNAs-like com maior expressão na fase de levedura, demonstram que estas moléculas regulam processos essenciais para a sobrevivência do patógeno, como a via para produção de energia, resposta a agentes oxidativos, determinação de polissacarídeos na parede celular, além de influenciaram nos processos de divisão celular e morfogênese. De modo geral os dados apontam para conservação de um mecanismo de regulação gênica pós-transcricional neste patógeno e tal fenômeno pode influenciar no desenvolvimento deste fungo durante a fase miceliana, na forma parasitária e durante a transição dimórfica.