Estratégias para aumentar a eficiência de dsRNA no silenciamento gênico no bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis

Abstract

Nos últimos anos diferentes estudos relataram o uso da tecnologia do RNA interferente para o controle de insetos-praga, por meio da produção de plantas geneticamente modificadas. Apesar do impacto, esta estratégia possui algumas limitações para sua aplicação, incluindo a degradação de moléculas de dsRNA no meio ambiente, como no intestino do inseto, bem como sua baixa internalização pelas células do epitélio intestinal do inseto. A presença de nucleases intestinais foi reportada em diferentes insetos de importância na agricultura, incluindo Schistocerca gregaria, Bombyx mori e Bemisia tabaci. Estudos anteriores relataram que para o bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis (Coleoptera: Curculionidae), a administração oral de dsRNA, por meio de dieta artificial, não é muito eficiente, não se sabendo o motivo, mas especulando-se a presença de nucleases intestinais. No presente estudo foram identificadas três nucleases no transcritoma do bicudo-do-algodoeiro, as quais foram validadas por análises in silico e silenciadas via RNAi por microinjeção, a fim de de avaliar o motivo da baixa eficiência do dsRNA no silencimento gênico, quando administrado via oral. Uma vez silenciadas as nucleases, a degradação do dsRNA pelo suco gástrico do bicudo-do-algodoeiro foi reduzida, o que contribui para o aumento do silenciamento gênico do gene-alvo. Demonstrada a presença de nucleases no intestino do bicudo-do-algodoeiro, este estudo abordou duas alternativas envolvendo a proteção da molécula de dsRNA e sua melhor internalização pelas células intestinais do bicudo-do-algodoeiro. Na primeira alternativa foram utilizadas nanopartículas de quitosana e dsRNA a fim de protegê-lo da degradação de nucleases intestinais de A. grandis. A tecnologia de nanoparticulas de quitosana vem sendo utilizada em estudos realizados com células animais na área farmacológica, bem como no controle de insetos-praga, como Aedes aegypti. Essa metodologia não só fez com que o dsRNA não fosse degradado pelas nucleases presentes no intestino do bicudo-do-algodoeiro, como contribuiu para significativa melhoria no silenciamento gênico do gene-alvo, quando comparado ao dsRNA livre. As nanopartículasde dsRNA também se mostraram altamente estáveis, quando aplicadas na superfície de plantas de algodão, demostrando potencial de serem utilizadas à campo, na forma de pulverização. A outra alternativa utilizada foi a proteína PTD-DRBD, que possui um domínio que facilita a fagocitose (PTD) e um domínio de ligação específico a dsRNA (DRBD). Essa proteína de fusão foi anteriormente caracterizada e vem sendo utilizada para entrega de ácidos nucléicos como droga em estudos da área farmacêutica. Em resumo, essa metodologia se mostrou bastante eficaz na proteção do dsRNA contra degradação de nucleases intestinais do bicudo-do-algodoeiro, além de ter causado melhor silenciamento gênico do gene-alvo, quando comparado ao dsRNA livre. Além disso, o complexo PTD-DRBD mediou a internalização celular do dsRNA pelas células do intestino do inseto. Ao contrário das nanopartículas de quitosana, essa metodologia pode ser utilizada para a produção de plantas transgênicas. O trabalho aqui apresentado contribui para os estudos envolvendo a eficiência do silenciamento gênico no bicudo-do-algodoeiro, inseto-praga de difícil controle via administração oral de RNAi. Os dados demostram a presença de nucleases no instestino do inseto, que podem ser, em parte, responsáveis pela degradação do dsRNA ingerido. O estudo também apresenta duas alternativas para contornar a degradação do dsRNA no intestino do bicudo-do6 algodoeiro: (1) nanopartículas de quitosana e dsRNA, que podem ser utilizadas na forma de pulverização, e (2) ribonucleoproteínas PTD-DRBD:dsRNA, que podem ser utilizadas, via planta transgênica. Ambas alternativas demostraram eficiência na proteção do dsRNA e são altamente promissoras para aplicações biotecnológicas contra o bicudo-do-algodoeiro e outros insetos-praga.