Transformação de trichoderma harzianum BRM27158 por agrobacterium tumefaciens e caracterização de uma biblioteca de transformantes

Abstract

Fungos do gênero Trichoderma são conhecidos agentes de controle biológico. Os mecanismos envolvidos em tal atividade abrangem as interações entre a tríade patógeno-antagonista-planta, num processo complexo e integrado que, além de proteger a planta, promove seu crescimento. Neste trabalho, buscou-se identificar possíveis genes alvo para melhoramento genético de Trichoderma harzianum. Para tanto, foi construída uma biblioteca de transformantes de T. harzianum BRM27158, por transformação mediada por A. tumefaciens, tendo o plasmídeo pFAT-gfp como vetor binário e gerando inserções aleatórias do T-DNA contendo os genes hph (marcador seletivo) e gfp (gene repórter). A biblioteca foi purificada por cultivo monospórico e submetida a uma triagem preliminar, da qual 10 linhagens foram selecionadas para este estudo. Todos os agrotransformantes selecionados exibiram estabilidade genética, mantendo o fenótipo de resistência à higromicina B após 6 gerações. A confirmação molecular da inserção do T-DNA se deu por amplificação dos genes hph e gfp com primers específicos. Os 10 fungos e o selvagem foram caracterizados quanto à produção de proteases em cultivo submerso e em meio sólido. Das dez linhagens, quatro (T25, T40, T113 e T136) apresentaram diminuição de crescimento em substratos proteicos. Além disso, os transformantes T40, T50 e T113 apresentaram acentuada redução da capacidade de inibir a bactéria Staphylococcus aureus, em comparação com o fungo selvagem. As regiões flanqueadoras do T-DNA de cada transformante selecionado foram recuperadas por TAIL-PCR, clonadas, sequenciadas e comparadas aos bancos de dados NCBI e JGI e ao genoma anotado de BRM27158. Foi identificada uma inserção num gene que codifica uma provável NRPS (peptídeo sintase não ribossômica), envolvida na produção de compostos secundários. A caracterização fenotípica, em concordância com a molecular, indicou alterações na produção de metabólitos secundários, mas não na produção de proteases. A biblioteca de agrotransformantes mostrou-se uma rica fonte para estudos de e caracterização funcional de genes envolvidos na interação da linhagem estudada com o fitopatógeno.