Novas aplicações do diagnóstico pré-natal não invasivo pela análise do plasma materno

Abstract

A descoberta do DNA fetal livre de células na circulação materna viabilizou o desenvolvimento de tecnologias para o diagnóstico pré-natal não invasivo. Neste trabalho foram desenvolvidos três estudos independentes relacionados a este tema. O objetivo do primeiro estudo foi determinar o haplótipo Y-STR do feto no plasma materno durante a gravidez e estimar, de forma não invasiva, se o suposto pai e feto pertencem à mesma linhagem masculina. O estudo incluiu casais com gravidez única e paternidade supostamente conhecida. O sangue periférico foi coletado em tubos EDTA (mãe) e em papel FTA (pai). O DNA do plasma materno foi extraído usando NucliSens EasyMAG (Biomerieux). O sexo fetal foi determinado por qPCR pesquisando o alvo DYS-14 no plasma materno e também foi confirmado após o parto. Dos voluntários incluídos, 20 mães com fetos masculinos e 10 mães com fetos femininos foram selecionadas para a análise de Y-STR. A moda da idade gestacional foi de 12 semanas. Todas as amostras de DNA foram submetidas a amplificação por PCR com kits PowerPlex Y23, ampFLSTR Yfiler e dois multiplexes próprios, que em conjunto representam 27 diferentes Y-STR. Os produtos de PCR foram detectados no analisador genético 3500 e foram analisados usando o software GeneMapper-IDX (Life Technologies). Os haplótipos fetais (formato Yfiler) foram comparados com outros 5328 haplótipos brasileiros disponíveis no banco de dados de referência de haplótipos cromossômicos Y (YHRD). Como resultado, entre 22 e 27 loci foram amplificados com sucesso a partir do plasma materno em todos os 20 casos de fetos masculinos. Nenhuma das mulheres com fetos femininos apresentou um haplótipo Y-STR falsamente amplificado. O haplótipo detectado no plasma materno correspondeu ao haplótipo do pai alegado em 16 dos 20 casos. Quatro casos apresentaram inconsistências simples e que não configuravam exclusões; 1 caso mostrou uma mutação no locus DYS458 devido à contração de uma unidade repetição e 3 casos apresentaram “dropout” em um dos locus DYS385 I/II. Todas as inconsistências foram 6 confirmadas após o nascimento do bebê. Dezesseis haplótipos fetais não foram encontrados em YHRD e um deles apresentou mutação, o que corresponde à probabilidade de paternidade de 99,9812% e 95,7028%, respectivamente. Três haplótipos fetais ocorreram duas vezes no YHRD, o que corresponde à probabilidade de paternidade de 99,9437%. Em conclusão, um haplótipo Y-STR fetal discriminatório pode ser obtido da análise do plasma materno durante a gravidez a partir da décima segunda semanas de gestação. Todos os fetos masculinos puderam ser atribuídos à linhagem masculina do pai alegado no início da gravidez. A alta probabilidade de paternidade associada a cada caso sugere que a relação não é aleatória e essa estratégia pode ser usada como alternativa para análise de parentesco fetal masculino. Posteriormente foi questionado se o DNA fetal estaria presente na microcirculação materna e se a determinação não invasiva do sexo fetal utilizando o sangue capilar coletado por punção digital é comparável aos resultados obtidos do plasma isolado do sangue venoso. Desta forma, o segundo estudo envolveu 101 voluntárias grávidas. A mediana da idade gestacional (min–max) foi 11 (8–20) semanas. Inicialmente o desenho experimental do estudo foi prospectivo. No entanto, após iniciar os experimentos resultados falsos positivos para o DNA masculino foram identificados nas amostras de sangue capilar usando um protocolo de assepsia com álcool isopropílico. Suspeitou-se da contaminação da pele dos dedos maternos com DNA exógeno masculino. Subsequentemente novos protocolos de assepsia do local de coleta do sangue capilar (ponta dos dedos) foram implementados (hipoclorito de sódio 0,5% tamponado aplicado duas vezes e hipoclorito de sódio 1% tamponado aplicado uma vez). Os resultados obtidos do plasma isolado do sangue venoso e capilar foram comparados com o sexo do recém-nascido ao nascimento. As análises revelaram que a sensibilidade e especificidade da determinação do sexo fetal no sangue venoso comparado ao sexo no nascimento foi 100% (95%IC 93- 100%) e 100% (95%IC 93-100%). No sangue capilar, os resultados foram 100% (95%IC 78-100%) e 58% (95%IC 27-84%) para o grupo do álcool isopropílico, 100% (95%IC 83-100%) e 100% (95%IC 82-100%) para o grupo do hipoclorito de sódio tamponado à 0,5%, e 100% (95%IC 80-100%) e 100% (95%IC 81-100%) para o grupo do hipoclorito de sódio tamponado à 1%, respectivamente. Em conclusão, o DNA fetal está presente no sangue capilar materno permitindo a determinação não invasiva do sexo fetal. O DNA masculino exógeno pode estar presente nas pontas dos dedos das mulheres grávidas e ser detectável gerando resultados falsos positivos. Por isto, a eliminação do DNA masculino exógeno é crítica para uma confiável determinação do sexo fetal usando o sangue capilar materno. As soluções de hipoclorito de sódio diluído e tamponado, entre 0,5% e 1% pode ser usado para eliminar o DNA masculino exógeno das pontas dos dedos das mulheres grávidas. Por fim, o uso do cromossomo Y no diagnóstico pré-natal não invasivo limita sua aplicação aos fetos masculinos. Portanto, seria importante o desenvolvimento de tecnologias para análise do DNA fetal independentemente do sexo fetal e que contemple os cromossomos autossômicos. Assim, hipotetizou-se usar os polimorfismos de inserção e deleção (Indels) presentes no pai e ausentes na mãe como “pequenas ilhas” de diferenças genéticas entre mãe e feto para o estudo pré-natal não invasivo das características genéticas do feto. Entretanto, antes de desenvolver esta metodologia seria necessário conhecer as frequências alélicas e os parâmetros forenses destes Indels usando um conjunto de marcadores que tenha sido previamente validado e de preferência na população local. O tema de pesquisa do terceiro estudo foi avaliar as frequências alélicas de 38 indels na população do Distrito Federal. Os resultados indicam que este conjunto é um sistema genético altamente informativo, pois a probabilidade de discriminar dois indivíduos selecionados ao acaso é de 99,9999999999993% e a probabilidade de excluir um indivíduo falsamente acusado em um caso de paternidade é 99,81%. Com base nas frequências alélicas foram calculadas as distâncias genéticas da população estudada (Distrito Federal) em relação as populações descritas em outros estudos (Portugal, África, Ásia, tribo Terena e do estado do Rio de Janeiro). A análise das distâncias genéticas entre as diferentes populações revelou que o Distrito Federal é mais semelhante ao Rio de Janeiro, assumindo uma posição intermediária em relação à Europa e Rio de Janeiro - Afrodescendente e foi distante dos nativos americanos, africanos e do leste asiático. Esta conclusão está de acordo com a composição da população relatada no Censo 2010, em que a maioria dos imigrantes era do Nordeste e do Sudeste. Estes três estudos foram aprovados por comitês de ética locais e todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre esclarecido.