Identificação de marcadores não invasivos para a competência ovocitária em bovinos

Abstract

O presente estudo objetivou determinar o melhor sistema de cultivo individual a ser utilizado e a quantidade relativa de RNAm de genes candidatos à marcadores de competência em biópsias de células do cumulus (CC) imaturas e maturadas de ovócitos com alta e baixa capacidade de produzir embriões in vitro. Foram realizados dois experimentos, sendo que no primeiro foram testados o efeito de dois tipos de cultivo individual (microgotas 20 μL e Cell Tak) na produção de embriões, o uso de ácido fólico como antioxidante em diferentes concentrações (0, 10, 20, 50 e 500 μM) na produção embrionária e no padrão de metilação de regiões do α- satélite e IGF2 e, o uso de ácido fólico isolado ou conjugado com ITS durante o cultivo em sistema individual na produção e qualidade dos embriões. Já no segundo foi determinada a quantidade relativa de RNAm para os genes GPC4, PTGS2, LUM, ALCAM, FSHR, PGR, GPX3, SERPINE2, HAS2, PRDX3, por PCR em tempo-real (qPCR) em biópsias de CC imaturas e maturadas. As biópsias utilizadas para o qPCR foram agrupadas conforme o resultado da produção de embriões em: CCOs que formaram blastocisto em D7(embrião); CCOs que não clivaram (não clivado) e, CCOs que clivaram, mas que não chegaram a blastocisto (clivado). No primeiro experimento, foi observado que o grupo Cell Tak apresentou menor taxa de clivagem (P≤0,05) e menor produção de embriões (P≤0,05) em D7 e D8 em relação ao grupo controle e microgotas de 20 μL. Em relação às diferentes concentrações de ácido fólico, o grupo 500μM apresentou uma redução nas taxas de clivagem em D6 (P≤0,05) em relação aos demais. Em D7, não houve diferença entre os grupos quando comparados ao grupo controle. Em relação a metilação da região α- Satélite, os grupos Controle, 20 μM e 500 μM apresentaram padrão semelhantes (P>0,05), que era hipometilado. Já para a região do éxon 10 do gene IGF2, o padrão de metilação foi diferente nos grupos 20 μM e 500 μM em relação ao controle (P ≤0,05). Quanto ao uso de ácido fólico e ITS, isolados ou associadosdurante o cultivo individual, foi observado que somente no grupo individual na presença de ITS, produção de embriões foi semelhante ao cultivado em grupo (P>0,05). No segundo experimento, dos 10 genes avaliados nas biópsias de CCs imaturas e maturadas, 2 genes apresentaram diferenças no nível de RNAm entre os grupos. O gene LUM mostrou-se mais expresso (P=0,02), enquanto que FSHR mostrou-se menos expresso (P= 0,09), ambos em CC maturadas de CCOs que desenvolveram em embrião, comparado as do grupo que não desenvolveu embrião. Conclui-se que o cultivo em gotas na presença de ITS proporcionou as melhores taxas de embriões e, que apesar do ácido fólico não afetar a produção altera o padrão de metilação do DNA. A expressão dos genes LUM e FSHR, em CCs maturadas está associada a capacidade do ovócito de formar embrião, podendo ser utilizados como marcadores não invasivos da competência ovocitária.