Revelando o potencial de Clonostachys byssicola em produzir enzimas holocelulolíticas

Abstract

Os fungos filamentosos saprofíticos representam fontes promissoras de enzimas holocelulolíticas, e o cultivo desses organismos em fontes de carbono indutoras baratas, como resíduos agrícolas, permitiria a obtenção de coquetéis enzimáticos com custos reduzidos. Neste trabalho, o potencial de um isolado de Clonostachys byssicola para a produção de enzimas holocelulolíticas é descrito. A avaliação do secretoma produzido pelo fungo em cultivo submerso com diversas fontes de carbono lignicelulósicas através de eletroforese em BN-PAGE revelou a presença de bandas de alta massa molecular, correspondentes à complexos proteicos putativos. A partir da identificação desses complexos por LC-MS/MS, verificou-se que os complexos abrigam diversas enzimas envolvidas na degradação de holocelulose, como celulases, mananases, xilanases e pectinases. Os complexos também são cataliticamente ativos, uma vez que foi possível identificar atividade enzimática in gel. Em outra etapa do trabalho, o secretoma do fungo obtido em fontes de carbono comerciais (Avicel, carboximetilcelulose-CMC e xilana de aveia) e agroindustriais (sabugo de milho, casca do grão de soja, engaço de bananeira e bagaço de cana-de-açúcar) foi caracterizado por LC-MS/MS. A maior diversidade de proteínas foi identificada no secretoma obtido em Avicel, seguido pelo secretoma obtido em sabugo de milho. Foram identificadas várias enzimas relacionadas à degradação da lignocelulose, o que evidencia que o fungo é capaz de produzir sistemas enzimáticos completos específicos para cada uma das principais frações da holocelulose: celulose, hemiceluloses e pectina. Os secretomas obtidos em resíduos agroindustriais foram empregados para sacarificar sabugo de milho e bagaço de cana-de-açúcar parcialmente delignificados. Os extratos brutos produziram mais açúcares a partir da hidrólise do sabugo, revelando uma maior digestibilidade deste substrato quando comparado ao bagaço, o que pode decorrer do menor teor de lignina observado após o tratamento do sabugo de milho. Os secretomas permitiram a solubilização de grande parte da xilana presente no sabugo de milho, com a liberação de xilobiose como principal produto de hidrólise. O isolado de C. byssicola foi ainda avaliado quanto à capacidade de produção de enzimas pectinolíticas quando cultivado em meio contendo casca de laranja como única fonte de carbono. O fungo foi capaz de secretar pectinases e pectato liases. A caracterização do secretoma feita por LCMS/MS revelou uma grande diversidade de enzimas atuantes na cadeia principal e sobre substituintes laterais. Uma fração parcialmente purificada foi caracterizada quanto ao efeito da temperatura e pH, e a atividade de pectinase foi máxima a 50ºC, e na faixa de pH entre 4,5 e 6,0. Estas características sugerem a aplicação da enzima para o tratamento de sucos de frutas com baixa acidez. Uma das enzimas parcialmente purificada foi identificada por LC-MS/MS, e a partir desta identificação, o transcrito correspondente foi clonado com sucesso em Escherichia coli, e a etapa de expressão em Pichia pastoris se encontra em andamento. Todos os resultados deste trabalho revelam C. byssicola como uma nova fonte de enzimas holocelulolíticas, que ainda precisa ser explorada.