Liofilização de espermatozóides bovinos : viabilidade estrutural e funcional

Abstract

A liofilização é um método que visa à preservação celular através da retirada da água dos sistemas biológicos por sublimação do gelo. Recentemente, a liofilização tem sido aplicada para preservar espermatozóides de mamíferos, representando uma ferramenta alternativa para conservação do material genético. Nesta tese foi testado o efeito da liofilização com diferentes meios protetores sobre a estrutura e a função dos espermatozóides bovinos. Para isto foram testados os seguintes meios: (T 1) - TCM hank’s com 10% de SFB; (T 2) - TCM hank’s com 10% de SFB e trehalose 0,2 M; (T 3) – Solução de EGTA, composta de 50mM/L de EGTA [ethylene glycol-bis (􀈕-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid] e 10mM/L de tris-HCl. Os efeitos da liofilização espermática foram estudados utilizando-se a microscopia óptica, para avaliar motilidade, retenção de cauda e de acrossoma com o uso da coloração de giemsa; a microscopia eletrônica, para avaliar ultra-estruturas importantes, tais como: membrana plasmática, acrossoma, mitocôndrias e microtúbulos; microscopia de fluorescência para avaliar a condição nuclear, através das técnicas de acridine orange test (AOT) e terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUDP nick-end labeling (TUNEL); e finalmente a injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI), para verificar o potencial de fecundação e de desenvolvimento embrionário dos espermatozóides liofilizados. Os resultados do primeiro trabalho indicaram que a viabilidade nuclear pode ser preservada de acordo com o meio protetor utilizado. Ainda demonstrou que a técnica de TUNEL é mais sensível que AOT para identificar danos nucleares, sendo a mais indicada para esta finalidade. No segundo trabalho, os dados revelaram que a liofilização ainda é um método agressivo aos espermatozóides, danificando a membrana plasmática e tornando-os imóveis. Porém, algumas estruturas, como acrossomo e mitocôndrias foram preservadas em todos os tratamentos. O núcleo foi melhor preservado nos meios com trehalose e EGTA. Estes tratamentos com a menor porcentagem de fragmentação nuclear também apresentaram as melhores taxas de cabeças descondensadas, formação de pró-núcleos e desenvolvimento embrionário, confirmando a avaliação de TUNEL. Estes resultados indicaram que o espermatozóide liofilizado participa do processo de fecundação quando utilizado pela ICSI. Entretanto, estudos adicionais são necessários, sendo que a melhoria desta tecnologia dependente dos meios protetores e de avanços na técnica de ICSI nos bovinos. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Lyophilization is a procedure developed for cell preservation, as a result of restriction of active water from biological systems by ice sublimation. Recently, freezedrying process has been used to preserve mammalian spermatozoa, becoming an alternative tool for genetic material preservation. In the present thesis the effect of lyophilization with different protecting medium on the bovine sperm cells structure and function was evaluated. The following medium were tested: (T 1) - TCM Hank’s with 10% FCS; (T 2) - TCM Hank’s with 10% de SFB and trehalose 0,2 M; (T 3)–EGTA solution, composed of 50mM/L de EGTA [ethylene glycol-bis (􀈕-aminoethyl ether)- N,N,N’,N’- tetraacetic acid] and 10mM/L of Tris-HCl. Effects of sperm lyophilization were evaluated using optical microscopy analysis to assess motility, maintenance of the tail, and acrosome integrity by trypan-bleu/giensa stain; electron microscopy analysis was used to evaluated ultrastructure of important components such as plasma membrane, acrosome and microtubules; fluorescence microscopy was used to analyzed nuclear integrity by Acridine Orange Test (AOT) and terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUDP nick-end labeling (TUNEL); and finally, intracytoplasmic sperm injection (ICSI) to verify the fecundity and embryo development potential of lyophilized spermatozoa. The results of the first experiment indicated that nuclear viability preservation depends on the protector media utilized. In addition, it showed that TUNEL technique is more sensitive than AOT to detect nuclear damage, being the most indicated for nucleus evaluation. In the second experiment, data demonstrated that lyophilization is an aggressive procedure for the sperm cells, causing damage in the plasma membrane and lost of motility. However, other cell components such as acrosome and mitochondria were similarly preserved in all treatments. Nuclei were better conserved in medium containing EGTA and trehalose. Those treatments, which had lower of fragmented DNA, also presented higher rates of decondensed sperm head, pronucleus formation and embryo development, confirming TUNEL evaluation. Theses results suggested that freeze-drying spermatozoa participate in the process of fertilization when used for ICSI. However, additional studies are needed, being the improvements in this technology reliant on the adequate protector media and in the higher efficiency of ICSI technique.