Variabilidade genética de NEF em amostras de HIV-1 circulantes

Abstract

Em 2005, cerca de 40 milhões de pessoas viviam com HIV/AIDS no mundo. Desse total, aproximadamente 600 mil residiam no Brasil. Em vista do elevado percentual de infecções pelo HIV-1, o desenvolvimento de vacinas contra esse vírus é uma das prioridades no que se refere à saúde pública mundial. Entretanto, apesar dos estudos sobre esse vírus, pouco se conhece sobre a importância da sua diversidade genética para a eficácia de potenciais vacinas. Assim, conhecer a variabilidade do HIV-1 em diferentes partes do mundo, bem como o seu perfil antigênico, pode ser de fundamental importância para a aplicação dessas. Uma das proteínas mais imunogênicas do HIV-1 é Nef, que desempenha diversas funções importantes durante a infecção viral in vivo, como, por exemplo, aumentar a infectividade e a replicação viral e modular negativamente proteínas presentes na superfície celular. Por essas características, Nef pode ter papel importante na imunização contra o vírus. O presente trabalho teve como objetivo principal analisar amostras de uma série histórica de isolados do HIV-1 circulantes no Distrito Federal e no estado de Rondônia e, desse modo, contribuir para a caracterização desses vírus, pela descrição da variabilidade do gene nef. Além disso, foram avaliados motivos e resíduos importantes para as atividades biológicas de Nef. Para isso, 33 amostras, 17 do Distrito Federal e 16 de Rondônia, foram amplificadas por nested-PCR para o gene nef e seqüenciadas. Todas foram caracterizadas como pertencentes ao subtipo B. Pela dedução da seqüência de aminoácido foi possível observar que duas amostras apresentaram códons de parada prematuros, devido a mutações que levaram a mundança na fase de leitura do gene. Os motivos e resíduos associados às atividades biológicas de Nef também foram analisados. Os sítios de miristoilação, fosforilação por PKA e reconhecimento de Nef pela protease viral encontraram-se conservados em 100%, 66,6% e 69,7% das amostras, respectivamente. Em relação à modulação de CD4 por Nef, 36,4% das amostras apresentaram todos os motivos e resíduos conservados. Os motivos e resíduos associados à modulação negativa de MHC de classe I estiveram conservados em 57,6% das amostras analisadas, enquanto 54,5% dos isolados apresentaram os motivos envolvidos na modulação de MHC de classe II. Quanto à modulação de CD1d, 45,4% das amostras apresentaram a totalidade de motivos e resíduos associados a essa atividade conservados, enquanto aqueles associados à modulação de CD28 estiveram conservados em 81,8%. Enquanto 93,9% das amostras apresentaram o motivo e o resíduo associados à sinalização para apoptose celular conservados. Em relação às alterações em vias de sinalização celular, 63,6% das amostras apresentaram os motivos e resíduos responsáveis pela interação de Nef com domínios SH3 conservados, enquanto 84,8% mostraram-se conservadas para aqueles necessários para a interação de Nef com proteínas Pak. Quanto aos epitopos de Nef reconhecidos por linfócitos T CD4, 18 dos 29 já descritos na literatura foram observados, sendo que o mais freqüente foi encontrado em 75,8% das amostras. Em relação aos epitopos de Nef reconhecidos por linfócitos T citotóxicos considerados ótimos, o mais freqüente foi observado em 84,8% das amostras. Pelo fato de Nef ser uma das regiões imunodominantes do HIV-1, bem como ser uma proteína da fase precoce da infecção, vacinas que utilizem suas porções antigênicas encontram-se em desenvolvimento. Dessa forma, a caracterização da variabilidade do gene nef pode ser de grande importância para o desenvolvimento de estratégias de utilização de potenciais vacinas anti-HIV-1 futuramente no Distrito Federal e em Rondônia. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Nearly forty million people around the world were living with HIV/AIDS in 2005, about six hundred thousand in Brazil. Thus, the development of vaccines against this virus is a world public health priority. However, despite several studies concerning this virus, little is known about the relevance of its genetic variability to the efficacy of potential vaccines. Consequently, knowing the HIV-1 variability in different parts of the world, and also its antigenic profile, may be of high importance for the applicability of those vaccines. Nef is one of the most immunogenic proteins of HIV-1, it performs many important functions during the viral infection in vivo, such as increase the viral infectivity and replication, and downmodulate proteins of the cell surface. For these characteristics, Nef may have an important role in the immunization against the virus. The present study had as main objective the analysis of samples from a historical series of isolates of HIV-1 circulating in Federal District and Rondônia, and the contribution to the characterization of this virus, by the description of the variability of the nef gene. Additionally, the conservation of important motifs and residues related to the biological activities of Nef were also analyzed. With this purpose, thirty-three samples, seventeen from Federal District and sixteen from Rondônia, were amplified by nested-PCR for the nef gene and sequenced. All of them clustered with subtype B references isolates in the philogenetic analysis. The motifs and residues associated to Nef biological activities were also analyzed. The miristoilation, fosforilation by PKA and recognition of Nef by the viral protease sites were conserved in 100%, 66,6% and 69,7% of the samples, respectively. Considering the CD4 modulation by Nef, 36,4% of the samples presented all the motifs and residues conserved. 57,6% and 54,5% of the samples had all motifs and residues associated to the down-modulation of MHC class I and to the modulation of MHC class II conserved, respectively. Considering the downmodulation of CD1d, 45,4% of the samples had all the motifs and residues associated to this activity, while 81,8% had those associated to the modulation of CD28. 93,9% of the samples had the motif and the residue associated to the signalization of cell apoptosis conserved. Considering Nef effects on cell signalization pathways, 63,6% of the samples presented the motifs and residues responsible for the interaction of Nef with SH3 domains, while 84,8% had those necessary to the interaction of Nef with Pak proteins. Considering the Nef epitopes recognized by T CD4 lymphocytes eighteen of the twenty-nine previously described were observed, the most frequent one occurred in 75,8% of the samples. Considering the Nef epitopes recognized by T cytotoxic lymphocytes, the most frequent one was observed in 84,8% of the samples. Because Nef is one of the most immunodominant regions of HIV-1 virus, as well one early phase protein, vaccines that use its antigenic regions are in development. In this way, the characterization of the variability of the nef gene may be of high importance to the development of utilization strategies for the potential anti-HIV-1 vaccines in Federal District and Rondônia in the future.