Inibição mediada pelo EDTA protege o DNA fetal livre de células de degradação ex-vivo em amostras de sangue

Abstract

O impacto pré-analítico da atividade DNase existente no sangue sob o DNA livre de célula (cfDNA) não está claro e nem foi bem estudado. Como o cfDNA fetal (cffDNA) se origina da placenta, o aporte termina quando o sangue materno é colhido e a sua quantidade não aumenta na amostra ex-vivo, ao contrário do que pode ocorrer com o cfDNA genômico. Portanto, o cffDNA é uma ferramenta sensível para avaliar a atividade e o impacto ex-vivo destas enzimas que degradam DNA, sendo este o objetivo do presente estudo. O plasma-EDTA e o soro de mulheres grávidas de fetos masculinos foram submetidas à diferentes condições de temperaturas, de modo a investigar a estabilidade do cffDNA. Em seguida, a ação de uma DNase exógena sobre o cffDNA foi avaliada tratando ou não as amostras com DNAse I. Em todas as situações, o cffDNA foi quantificado utilizando sequências-alvo específicas do cromossomo Y (DYS-14). Além disso, desenvolveu-se um ensaio baseado na degradação de uma sonda de hidrólise para qPCR com a finalidade de medir a atividade DNase endógena diretamente em amostras primárias. Por fim, uma diluição seriada de EDTA foi adicionada ao plasma fresco (não-anticoagulado) e ao soro antes do ensaio para medir a atividade DNase endógena com afinalidade de pesquisar a inibição das DNases sanguíneas mediada por este anticoagulante. Observou-se uma menor quantidade de cffDNA no soro em relação ao plasma. Além disso, uma maior diminuição do cfDNA mediada pela temperatura foi observada no soro quando comparada ao plasma-EDTA. O tratamento com a DNAse I não alterou o cffDNA no plasma, mas causou a sua degradação total no soro. Adicionalmente, a atividade DNase endógena foi de 14,9 vezes maior no soro quando comparada ao plasma-EDTA. Por fim, a adição de doses crescentes de EDTA ao plasma fresco e ao soro resultaram em uma inibição dose-depedente da atividade DNase endógena nestas amostras. Em conclusão, cffDNA está protegido de degradação mediada pela temperatura no plasma-EDTA. DNases endógenas e exógenas estão mais ativas no soro e o anticoagulante EDTA inibe as DNases do sangue conferindo proteção exvivo ao cffDNA.