Avaliação do efeito microbicida da filosseptina-1 nas formas amastigotas de Leishmania amazonensis in vitro

Abstract

Doenças infecciosas são as principais causas de morte no mundo. Dentre essas doenças, a leishmaniose destaca-se no Brasil e no mundo pelo seu caráter endêmico e grande incidência, além disso, as manifestações clínicas, que variam das formas cutâneas à forma visceral, dependem da espécie do parasito bem como do sistema imunitário do indivíduo. O tratamento da doença baseia-se nos compostos antimoniais pentavalentes, que apesar de eficazes apresentam grande toxicidade para o hospedeiro e induzem mecanismos de resistência dos parasitos. Esses aspectos estimulam os estudos para identificar novos compostos voltados ao tratamento da leishmaniose. Os peptídeos antimicrobianos são promissores agentes leishmanicida, pois suas características estruturais e eletrostáticas lhes permitem interagir com as membranas celulares dos parasitos causando seu rompimento. Considerando o efeito microbicida da filosseptina-1 (PSN-1) nas formas promastigotas de Leishmania amazonensis e considerando que os macrófagos são as principais células envolvidas na patogênese da leishmaniose, o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito microbicida da PSN-1 nas formas amastigotas de L. amazonensis e determinar se esse efeito relaciona-se com a produção das espécies reativas de oxigênio ou com a formação dos corpúsculos lipídicos. Formas amastigotas axênicas foram obtidas pela incubação de cultivos promastigotas de L. amazonensis por 96 horas a 37°C, seguindo-se a infecção dos macrófagos por 8 horas. Cultivos infectados foram tratados com diferentes concentrações da PSN-1 (0, 2, 16 e 64 μg/mL) por 2 h para avaliar o efeito microbicida pela determinação do índice de infecção, para determinar no sobrenadante das culturas, a produção de óxido nítrico após 24 h de incubação pelo método de Griess e de peróxido de hidrogênio após 1 h de incubação pelo método de Pick e Keisari; para a quantificação dos corpúsculos lipídicos utilizou-se o método da coloração com óleo vermelho. Os resultados mostraram que, quando comparado ao controle basal, o efeito microbicida da filosseptina-1 ocorreu nas três concentrações reduzindo o índice de infecção de macrófagos em 52%, 81% ou 96% com 2, 16 ou 64 μg/mL, respectivamente (p<0,05); a produção de óxido nítrico aumentou com as três concentrações de PSN-1 (p<0,05); a produção de peróxido de hidrogênio não foi afetada pelo tratamento com as menores concentrações do peptídeo, no entanto a maior delas (64 μg/mL) causou redução desse radical, na presença ou não da infecção. O índice corpuscular aumentou com a menor concentração do peptídeo (2 μg/mL) devido ao aumento no percentual de macrófagos que expressavam corpúsculos lipídicos; o tratamento com 16 μg/mL também aumentou o percentual de macrófagos que exibiam corpúsculos lipídicos. Os resultados mostraram que o efeito microbicida ocorreu em um padrão dose-dependente, em que, a concentração máxima (64 μg/mL) foi capaz de reduzir em 96% o índice de infecção dos macrófagos, após 2 horas de incubação com o peptídeo. Em conjunto, o efeito das diferentes concentrações da PSN-1 nas formas amastigotas de L. amazonensis indicou o potencial desse peptídeo no tratamento da leishmaniose. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Infectious diseases are the leading causes of death worldwide. Among these diseases, leishmaniasis stands out in Brazil and in the world for its endemic nature and its widespread prevalence; furthermore its clinical manifestations, range from cutaneous forms to visceral forms, depending upon the species of the parasite and on the immune system of the individual. Disease control is based on treatment with pentavalent antimonial compounds, which, while effective, have high toxicity to the host, and induce the generation of parasitic resistance mechanisms. These aspects encourage studies to identify novel compounds aimed at treating leishmaniasis. Antimicrobial peptides are promising leishmanicidal agents because their structural and electrostatic characteristics allow them to interact with the cell membranes of parasites causing their breakup. Considering the microbicidal effect of phyloseptin-1 (PSN-1) on promastigotes of Leishmania amazonensis and considering that macrophages are the main cells involved in the pathogenesis of leishmaniasis, the objective of this study was to evaluate the microbicidal effect of PSN-1 in amastigotes of L. amazonensis and to determine whether this effect is related to the production of oxygen reactive species or the formation of lipid bodies. Axenic amastigotes were obtained by incubation of promastigote cultures of L. amazonensis for 96 hours at 37 ° C, followed by infection of macrophages for 8 hours. Infected cultures were treated with different concentrations of phyloseptin-1 (0, 2, 16 and 64 μg /mL) for 2 h to evaluate the microbicidal effect by determining the infection rate and also to determine the supernatant of cultures producing nitric oxide after a 24 hour incubation by the Griess method of hydrogen peroxide after a 1 hour incubation by the Pick and Keisari method. For the quantification of lipid bodies we used the method of staining with Red Oil. The results showed that compared to the basal control, the microbicidal effect of PSN-1 was present in all three doses reducing the infection rate of macrophages, after treatment with the peptide or not, by 52%, 81% or 96% with 2, 16 or 64 μg/mL, respectively (p<0.05); The production of nitric oxide increased with the three concentrations of PSN-1 (p<0.05); production of hydrogen peroxide was not affected by treatment with lower concentrations of the peptide, however, most of them (64 μg/mL) caused a reduction of this radical in the presence or absence of infection. The corpuscular index increased with the lowest concentration of the peptide (2 mg/mL) due to the increase in the percentage of macrophages expressing lipid bodies; treatment with 16 μg/mL also increased the percentage of macrophages that exhibited lipid droplets. The results show that the microbicidal effect occurred in a dose-dependent pattern, wherein the maximum concentration (64 μg/mL) was able to reduce in 96% the rate of infection of macrophages after 2 hours incubation with the peptide. Altogether, the effect of different concentrations of PSN-1 in amastigotes of L. amazonensis indicate the potential of this peptide in the treatment of leishmaniasis.