Validação funcional de genes envolvidos com estresse de Meloidogyne incognita via RNA interferente in planta

Abstract

O fitonematoide Meloidogyne incognita é considerado um dos patógenos de plantas mais relevantes devido a sua distribuição mundial e os danos severos causados a várias culturas importantes agronomicamente. Práticas agronômicas têm tido geralmente pouco sucesso e alto custo, sendo o cultivo de variedades resistentes, quando existentes, a forma mais eficiente de controle. Uma estratégia alternativa promissora é a transformação genética de plantas para expressão de moléculas que afetem o metabolismo e desenvolvimento do nematoide. No presente trabalho foram selecionados dois genes-alvo homólogos a genes essenciais do nematoide modelo Caenorhabditis elegans para silenciamento gênico de M. incognita in planta: Isocitrato liase e hsp90. Visando a validação desses genes, para o controle deste fitonematoide, os fragmentos gênicos foram isolados e clonados em um vetor binário para expressão de dsRNA in planta. Plantas transgênicas de Nicotiana tabacum contendo as construções de RNAi foram obtidas através de transformação via Agrobacterium tumefaciens. As plantas expressando dsRNA de hsp90 apresentaram uma atraso na formação de galhas e menor número de células gigantes, observado aos 14 DAI. Os bioensaios com as plantas de tabaco GM nas gerações T1 e T2 mostraram os efeitos do silenciamento dos genes-alvo na reprodução do nematoide. Os testes de resistência mostraram, 45 DAI, uma redução média de 65% nos ovos por grama de raiz nas plantas expressando dsRNA de Isocitrato liase e redução média de 30% nas plantas expressando dsRNA de hsp90. A análise do silenciamento de hsp90 em ovos coletados das plantas expressando dsRNA foi confirmada por qRT-PCR. Em conclusão, genes-alvo com efeitos essenciais foram encontrados, exercendo papel importante no desenvolvimento e reprodução do nematoide. Portanto, essa metodologia pode ser utilizada como uma ferramenta biotecnológica para indução de resistência ao fitonematoide M. incognita em grandes culturas de interesse comercial. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The phytonematode Meloidogyne incognita is considered the most important plant pathogen, because its worldwide distribution and the severe damage caused to a large variety of agronomically important crops. The phytopathogen has a life cycle that is divided in six developmental stages (Egg, Juvenile 1-4, Female) that can persist for 6 to 8 weeks. The Juvenile 2 enters the root using mechanical force and enzymatic degradation to establish the plant-pathogen interaction that finally differentiates in female that deposit 2,000 eggs. Current agronomic practices have usually been unsuccessful and expensive, so the cultivation of resistant varieties is actually the most efficient way to control nematodes. In this work, we selected target genes for silencing homologues lethal genes of the model nematode Caenorhabditis elegans. Aiming validation of these target genes, the fragments were isolated, cloned in RNAi binary vector for tobacco transformation via Agrobacterium tumefaciens. After this, tobacco seeds were collected and genotyped to select the transformed ones. Bioassays on GM tobacco showed the effects of silencing in the nematode reproduction. The resistance tests conducted with GM tobacco at 45 DAI showed a reduction of 65% in eggs per root gram in transgenic lines of Isocitrate lyase and 30% in transgenic lines of hsp90. In conclusion, we found new target genes that showed deleterious phenotype in nematodes. Therefore, this methodology can be used as a promising biotechnological tool to induce nematode resistance in GM crops.