Análise crítica do método de produção "in vitro" e tranferência de embriões bovinos a partir de oócitos captados "in vivo" e maturados em meio comercial e meios patenteados

Abstract

A técnica de produção in vitro de embriões (PIVE) refere-se a uma série de procedimentos in vitro, maturação (MIV), fertilização (FIV) e cultura do zigoto (CIV), necessárias para produzir embriões a partir de oócitos imaturos. Para avaliar a viabilidade e a competência do embrião é evidente que a transferência deste para fêmea receptora (TE) e a análise do neonato é o que vai definir a real efetividade dos processos de PIVE. O nosso objetivo é a montagem e padronização das técnicas de PIVE e TE, validação das técnicas in vitro pela produção de embriões provenientes de oócitos captados por aspiração folicular e maturados em meio TCM-199; e oócitos de matadouro maturados em meios testes de α-MEM e controle comercial. Em busca de melhores condições de cultura e de um sistema in vitro que fosse menos variável e, ao mesmo tempo, que simulasse a maturação do oócito observada no animal in vivo, desenvolvemos vários sistemas de cultura para a MIV, nos quais meios definidos foram formulados, testados e alguns patenteados. Os meios foram: α-MEMC, α-MEMB e α–MEMO. O primeiro meio, mais complexo, utiliza hormônios e agentes oxidantes, o segundo meio, não contém hormônios e o terceiro é composto pelo diluente. Ao serem comparados com o meio controle TCM-199, inibiram a maturação nuclear, produziram menor grau de poliespermia (α-MEMC), produziram a mesma porcentagem de embriões. FSH de suíno foi usado nos meios α-MEMB e α–MEMO e não houve diferenças na porcentagem de embriões produzidos calculados com base no número de oócitos. Estes experimentos foram realizados com ovários provenientes de abatedouros. In vivo foram coletados 600 oócitos de doadoras mestiças girolandas, maturados no meio controle TCM-199, sendo os embriões transferidos para as fêmeas receptoras aneloradas, previamente escolhidas, e preparadas por protocolo hormonal para a sincronização do cio e avaliadas com ultrassom para receber o embrião de FIV. Os demais embriões formados nos meios testes foram congelados para estudos futuros de expressão de gens de competência e viabilidade e epigenética. Após a TE as fêmeas receptoras foram monitoradas e avaliadas 30 e 90 dias após PIVE para verificar a taxa de gestação; sendo confirmada a prenhez, as fêmeas receptoras foram separadas para acompanhamento da gestação até o momento do parto. As taxas de prenhez foram de 40%, as de nascimentos 25% e de neonatos saudáveis 20%, valores iguais ou maiores dos relatados na literatura. De maneira importante, a metodologia apresentada neste trabalho é a parte prática realizada in vivo, que envolve a captação de oócitos por aspiração folicular, a preparação da receptora, a transferencia dos embriões de PIVE, a avaliação da prenhez e do neonato; representam uma alternativa viável para serem utilizadas em experimentos futuros e para a aplicação comercial. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The technique of production in vitro embryos (PIVE) refers to a series of procedures in vitro maturation (IVM), fertilization (IVF) and zygote culture (MIC) needed to produce embryos from Immature oocytes. To assess the viability and competence of the embryo is evident that this transfer to recipient female (TE) and the analysis of the neonate is what will define the actual process effectiveness PIVE. Our goal is the assembly and standardization of techniques and PIVE TE, and validation techniques in vitro by the production of embryos from oocytes by ovum and matured in TCM-199; slaughterhouse and oocytes matured in means tests of α-MEM and commercial control. In search of a better culture and a system in vitro that was less variable and at the same time, to simulate oocyte maturation observed in animal in vivo, developed several systems for IVM culture, in which defined media were formulated, tested and patented some. The means were: MEMC-α, α-MEMB and α-MEM. The first half, more complex, uses oxidizing agents hormones and the second half contains no hormones and the third consists of the diluent. To be compared with the control medium TCM-199, inhibited nuclear maturation, produced a low degree of polyspermy (α-MEMC), produced the same percentage of embryos. FSH pig was used in the media and MEMB α-α-MEM and there were no differences in the percentage of embryos produced calculated based on the number of oocytes. These experiments were performed with ovaries from slaughterhouses. In vivo 600 oocytes were collected from crossbred donors Girolanda, matured in control medium TCM-199, and the embryos transferred (ET) for females receiving graded Nelore, previously chosen and prepared by hormonal protocol for synchronization of estrus and evaluated with receiving ultrasound to IVF embryos. The remaining embryos formed in means tests were frozen for future studies of expression of genes of competence and viability and epigenetics. After receiving TE females were monitored and evaluated 30 and 90 days after PIVE to verify pregnancy rate, pregnancy is confirmed, the recipient females were separated for the monitoring of pregnancy until delivery. Pregnancy rates were 40%, the 25% of births and 20% of healthy neonates, equal or higher values reported in the literature. Importantly, the methodology presented in this paper is the practical performed in vivo, which involves the collection of oocytes by ovum, the preparation of the recipient, the transfer of embryos PIVE, assessment of pregnancy and the newborn, represent a viable alternative for use in future experiments and for commercial application.