Produção de Virus Like Particles de Norovírus GII.4 para seleção de anticorpos monoclonais humanos a partir de biblioteca apresentada em fagos

Abstract

Os Norovírus (NV) são responsáveis pela maioria das gastroenterites humanas não bacterianas em todo o mundo. Devido ao fato das estirpes de NV humanos não possuírem a capacidade de replicação em culturas celulares, a utilização de Virus like particles (VLPs) na compreensão dos fatores imunológicos e físico-químicos torna-se uma boa alternativa para o estudo do genogrupo II genótipo 4 que é considerado o mais prevalente e está associado à epidemia global. O objetivo deste estudo foi produzir VLP de NV variante 2006b e selecionar anticorpos monoclonais humanos a partir de biblioteca apresentada em fagos após a purificação das proteínas. A maior vantagem em utilizar a técnica de Phage Display é a possibilidade da seleção de fragmentos de anticorpos monoclonais totalmente humanos que podem ser utilizados em ensaios clínicos. Foram comparados os métodos de purificação de cloreto de césio (CsCl) e cromatografia de troca iônica, sendo que esta última apresentou um melhor rendimento no que diz respeito à quantidade e pureza das proteínas de capsídeo obtidas. Dos 58 clones analisados após 4 ciclos de seleção utilizando VLP de NV como antígeno, dez foram analisados com Sfi I e BstO I com relação ao perfil e diversidade. Porém, as possíveis recombinações existentes determinaram a esperada diminuição da diversidade da biblioteca ao longo dos ciclos de seleção apesar dos Fabs reconhecerem especificamente o antígeno diferentemente da diversidade inicial, ou seja, na construção da biblioteca. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

The Norovirus (NV) are responsible for most human nonbacterial gastroenterites worldwide. Because human strains of NV do not have the ability to replicate in cell cultures, the use of virus-like particles (VLPs) in understanding the immunological and physicochemical aspects becomes a good alternative for the study of genogroup II genotype 4, which is considered the most prevalent and is associated with the global epidemic. The aim of this study was to produce VLPs NV 2006b variant and select human monoclonal antibodies from phage-displayed library after purification of proteins. The major advantage in using the technique of phage display is the possibility of selecting fragments of fully human monoclonal antibodies that can be used in clinical trials. The methods of purification of cesium chloride (CsCl) and ion exchange chromatography were compared and the latter had a better performance as regards the amount and purity of the capsid proteins obtained. Of the 58 clones analyzed after 4 cycles of selection using the NV VLP as antigen, ten were analyzed with Sfi I and BstO I with respect to the profile and diversity. However, the possible existing recombinations led to an expected decrease of the library’s diversity during the selection cycles, though Fabs specifically recognized the antigen differently from the initial variety, that is on the construction of the library.