Replicação e movimento diferencial de tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) e perfil de expressão de microRNAs em genótipos resistente e suscetível de tomateiro

Abstract

Os begomovírus pertencem à família Geminiviridae e são transmitidos eficientemente pelo vetor Bemisia tabaci, conhecido como mosca-branca. Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) é um dos principais begomovírus que afetam a cultura do tomateiro no Brasil. Plantas infectadas com ToCMoV geralmente desenvolvem sintomas de clorose internerval, manchas cloróticas e mosqueado amarelo. ToCMoV e outros begomovírus do Novo Mundo são compostos por dois componentes de DNA circular de fita simples (conhecidos como DNA-A e DNA-B) que se replicam no núcleo das células infectadas. Uma das melhores estratégias para controle da dispersão da doença é o emprego de cultivares resistentes. Recentemente, uma linha quase isogênica de ‘Santa Clara’ (SC) chamada ‘LAM 157’, carregando o gene de resistência tcm-1, foi obtida pela Embrapa Hortaliças. O gene tcm-1 confere resistência a diferentes espécies de begomovírus e é caracterizado pela redução ou ausência de sintomas e restrição do acúmulo viral em plantas infectadas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a resistência conferida na linhagem LAM 157 em resposta à infecção causada pelo begomovírus ToCMoV. Os mecanismos de replicação e movimento viral a longa distância foram avaliados na linhagem LAM 157 e na linhagem suscetível ‘Santa Clara’. A replicação viral foi analisada por meio de agroinfiltração de folíolos com o DNA-A de ToCMoV seguida de quantificação absoluta do acúmulo viral resultante por qPCR no segundo, sexto e décimo dias após a agroinfiltração. A quantidade de DNA viral aumentou com o tempo em todas as plantas infectadas, evidenciando a replicação viral. No entanto, essa quantidade foi estatisticamente menor em LAM 157. O movimento viral a longa distância foi avaliado por meio de dupla-enxertia sobre porta enxerto ‘Santa Clara’ infectado com ToCMoV e posterior análise por PCR, para determinar se a resistência conferida pela linhagem LAM 157 impediria a movimentação do vírus a longa distância. Foi possível detectar a presença de ToCMoV por PCR nos folíolos apicais do grupo controle, 10 dias após a primeira enxertia. Neste momento, não foi detectado vírus no grupo com enxertos de plantas resistentes, evidenciando um atraso no movimento viral. Trinta dias após a segunda enxertia, todas as plantas do grupo controle encontravam-se infectadas, enquanto no grupo com plantas LAM 157, em apenas duas de seis plantas foi detectada a presença do vírus. Os resultados sugerem que a resistência apresentada pela isolinha LAM 157 se deve a restrição na replicação viral aliada a uma menor eficiência no movimento viral. Os MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs endógenos que regulam a expressão de diversos genes que estão envolvidos com muitos processos biológicos fundamentais. Para verificar uma possível expressão diferencial de miRNAs em tomateiros inoculados com ToCMoV, foram analisados o acúmulo de miRNAs previamente associados com o desenvolvimento da planta e miRNAs relacionados com as respostas à estresse. Plantas suscetíveis de SC e de plantas resistentes da linhagem 'LAM 157' foram inoculados por bombardeamento de partículas com clone infeccioso de ToCMoV. Ácidos nucleicos totais foram isolados a partir de folhas apicais com infecção sistêmica, 17 dias após a inoculação, e separados em gel desnaturante de poliacrilamida. Foram realizados Northern blots utilizando como sondas oligonucleótidos complementares aos miRNAs, marcados com γ32P-ATP na extremidade 5’. A quantidade de miRNAs 159, 164, 168 e 172 (previamente associados com o desenvolvimento da planta) acumulada pelas plantas controle, foi comparada nas plantas SC e ‘LAM 157’ infectadas com ToCMoV. Os resultados mostraram um acúmulo diferencial de miRNAs entre plantas resistentes e suscetíveis, infectados e controles inoculados. Estes resultados sugerem que a expressão dos miRNAs da planta hospedeira pode ser afetada em consequência da infecção por ToCMoV e podem refletir diferenças na intensidade da expressão de sintomas, bem como nos níveis de resistência ao vírus. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Begomoviruses belong to the Family Geminiviridae and are efficiently transmitted by the vector Bemisia tabaci, also known as whitefly. Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) is one of the main begomovirus species affecting tomatoes in Brazil. Plants infected with ToCMoV generally develop symptoms of vein chlorosis, chlorotic spots, and mottling. ToCMoV and other begomoviruses from New World are composed by two circular single stranded DNA components (known as DNA-A and DNA-B) that replicate in the nucleus of infected cells. One of the best strategies to control the disease spread is the use of resistant cultivars. Recently, a ‘Santa Clara’ (SC) near-isogenic line named ‘LAM 157’ carrying the resistance locus tcm-1 was obtained by Embrapa. The broad tcm-1 locus resistance to different begomovirus species is characterized by the reduction or absence of symptoms and restriction of virus accumulation in infected plants. This work aimed to describe the resistance conferred by the tcm-1 locus in ‘LAM 157’ in response to the infection caused by the begomovirus ToCMoV. The mechanisms of viral replication and movement were evaluated in resistant line LAM 157 and in susceptible line ‘Santa Clara’. Viral replication was analyzed in leaves vacuum-agroinfiltrated with the ToCMoV DNA-A, followed by the absolute quantification of viral accumulation by qPCR two, six and ten days after agroinfiltration. The amount of viral DNA increased with time in all the infiltrated plants reflecting viral replication, but it was significantly lower in ‘LAM 157’. For evaluation of viral long distance movement, a double grafting experiment was performed. ToCMoV infected SC plants were used as rootstock in two groups where scions of susceptible SC and resistant LAM 157 were grafted. In both, final scions were SC plants. ToCMoV was detected by PCR in apical leaves from control group 10 days after the first grafting. At this time, no virus was detected in resistant grafts confirming a delay in virus movement. Thirty days after the second grafting, all plants from the control groups were infected, while in the group of LAM 157 intergraft only in two of six plants were detected the presence of virus. The results indicated that the resistant response in “LAM 157” is due the restriction of viral replication, in addition to a lower efficiency of viral movement in these resistant plants. MicroRNAs (miRNAs) are small endogenous RNAs that regulate the expression of several genes that are involved in many important biological processes. To verify a possible differential expression of miRNAs in tomato inoculated with ToCMoV, the accumulation of miRNAs previously reported to be related to plant development and with stress responses was studied. Susceptible ‘Santa Clara’ (SC) plants and resistant ‘LAM 157’ plants were inoculated by particle bombardment with infectious clone of ToCMoV. Total nucleic acids were isolated from systemically infected leaves 17 days post inoculation and loaded in denaturing polyacrylamide gel. Northern blots were performed using as probes gamma32P-γATP end-labeled oligonucleotides complementary to miRNAs. The amount of miRNAs 159, 164, 168 and 172 (previously related with plant development) accumulated by control plants of SC and ‘LAM 157’ was compared with those in ToCMoV-infected plants. The results showed differential accumulation of miRNAs between infected susceptible and resistant plants and mock-inoculated controls. These results suggest that the expression of host miRNAs can be affected as a result of ToCMoV infection and may reflect differences in symptom expression intensity as well as in the levels of virus resistance.