Avaliação de mecanismos da resistência conferida pelo gene Ty-1 contra tomato chlorotic mottle virus -ToCMoV na linhagem de tomate LAM 144R

Abstract

A cultura de tomate no Brasil é uma das mais importantes do ponto de vista econômico e social. Estudos publicados pela FAO em 2011 posicionam o Brasil no oitavo lugar do ranking mundial de produção. O cultivo de tomateiro no Brasil é feito em diferentes estados e durante grande parte dos meses do ano, favorecendo a ocorrência de diferentes doenças de importância econômica, dentre elas, destacam-se aquelas causadas por espécies do gênero Begomovirus. O gênero Begomovirus encontra-se composto por espécies com partículas geminadas formadas por dois icosaedros incompletos e ácido nucleico do tipo ssDNA encapsidado em um componente ou dois componentes genômicos (DNA A e B), denominadas de monopartidas ou bipartidas, respectivamente. Até o presente momento no Brasil, em tomateiro, não foram relatadas espécies de begomovírus de genoma monopartido. Espécies de Begomovirus são transmitidas com grande eficiência pelo vetor Bemisia tabaci. Para controle das doenças causadas por espécies de Begomovirus esforços vêm sendo concentrados no desenvolvimento de materiais elite através da introgressão de genes de resistência, muitas vezes, provenientes de acessos selvagens do gênero Solanum. Um exemplo é a linhagem LAM 144R que contém o gene dominante Ty-1 caracterizado por conferir resistência a diferentes espécies de Begomovirus. Neste trabalho a linhagem LAM 144R foi avaliada com o objetivo de elucidar os mecanismos virais da resistência conferida pelo Ty-1 e a amplitude da resistência deste gene frente às espécies de Begomovirus bipartidos encontrados no Brasil: Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV), Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), Tomato severe rugose virus (ToSRV) e Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). A avaliação da replicação viral foi realizada mediante experimentos de agroinfiltação do componente A de ToCMoV na linhagem resistente LAM 144R e na isolinha suscetível LAM 144S. A quantificação da carga viral foi realizada por PCR quantitativa em tempo real (qPCR), usando primers específicos para capa proteica (CP1). Os dados foram analisados pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis. O título viral foi significativamente menor nas plantas da isolinha LAM 144R em comparação com LAM 144S, mostrando uma quantidade duas vezes menor de carga viral na linhagem resistente no décimo dia após a infiltração. Para avaliar o efeito deste gene no movimento a longa distância de Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) na linhagem LAM 144R duplas enxertias foram realizadas. Plantas LAM 144S (suscetível) foram inoculadas com ToCMoV. Duplas enxertias foram realizadas utilizando como enxerto segmentos de LAM 144R ou LAM144S e como sobre-enxerto, LAM 144S. Amostras foram coletadas em diferentes tempos após as enxertias e a detecção de ToCMoV por PCR e Southern blot mostraram uma restrição no movimento viral a longa distância quando foram usadas as plantas LAM 144R contendo o gene Ty-1 como enxerto Para o estudo da amplitude da resistência conferida pelo gene Ty-1 na linhagem LAM 144R, plantas foram inoculadas via biobalística com DNA das quatro espécies de Begomovirus mencionadas acima. Como controle positivo utilizou-se plantas de LAM 144S. As avaliações de sintomas foram realizadas aos 21 e 40 dias após inoculação (dai) e a acumulação viral foi avaliada aos 30 (dai) mediante Southern Blot usando sondas para o componente A de Begomovirus. Como resultado as plantas de LAM 144R inoculadas com ToCMoV apresentaram sintomas leves e baixa acumulação viral. Para ToSRV observou-se ausência de sintomas ou sintomas leves e baixa acumulação viral. Para ToRMV poucas plantas apresentaram sintomas leves e não foi detectada acumulação viral. Para ToYVSV observou-se sintomas leves em algumas plantas, um baixa acumulação viral em cinco delas e uma forte acumulação em duas amostras. Os resultados encontrados neste estudo demonstram que LAM 144R pode ser considerada promissora para uso em programas de melhoramento no desenvolvimento de diferentes cultivares comerciais. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The tomato crop in Brazil is important economically and socially. FAO placed, Brazil in the 8th position in the world rank of tomato production. Tomatoes in Brazil are grown in different states and during most months of the year, what favors the appearance of different diseases of economic importance, such as those caused by begomoviruses. Begomoviruses are transmitted very efficiently by the vector Bemisia tabaci. The genome can be either monopartite or bipartite (DNA A and DNA B). So far, only bipartite tomato begomoviruses have been reported in Brazil. To control diseases caused by begomovirus include the development of elite materials through introgression of resistance genes from wild Solanum accessions. An example is the line LAM 144R that contains the dominant gene Ty-1 which confer resistance to different Begomovirus species. This line LAM 144R was here evaluated in order to elucidate the mechanisms of viral resistance conferred by Ty-1. The breadth of this resistance was tested by inoculation with four bipartite Begomovirus-especies found in Brazil: Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV), Tomato rugose mosaic virus (ToRMV), Tomato severe rugose virus (ToSRV), and Tomato yellow vein streak virus (ToYVSV). As positive control LAM 144S were used plants. Symptoms were scored at 21 and 40 days after inoculation (dai) and viral accumulation was evaluated at 30 (dai) by Southern blot. As a result LAM 144R mild symptoms and low or no viral accumulation was observed with ToCMoV, ToSRV, ToRMV and ToYVSV. The evaluation of virus replication was carried out by agronfiltration experiments of ToCMoV DNA-A in the resistance LAM 144R and susceptible LAM 144S isolines. Quantification of the viral load was performed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) using primers specific for coat protein (CP1). Data were analyzed by nonparametric Kruskal-Wallis test. The viral titer was significantly lower in plants LAM 144R compared to the isoline LAM 144S, showing 2 times lower viral load in the resistant lineage ten days after agroinfiltration. To avaluate the effect of this gene on the long-distance movement of Tomato chlorotic mottel virus , in near isogening lines LAM 144R and LAM 144S, double grafts were performed. Plants LAM 144S (susceptible) were inoculated with ToCMoV. Double grafts were performed using graft segments of LAM 144R and LAM 144S and as overgraft, LAM 144S plants. Samples were collected at different times after grafting and ToCMoV was detected by PCR, Southern blot, and tissue blott showing a restriction in long-distance viral movement when plants LAM 144R containing the Ty-1 gene was used as graft. The results of this study demonstrate that LAM 144R can be considered promising for the use in breeding programs for the development of new resistent cultivars. The evaluation of virus replication was carried out by agronfiltration of ToCMoV DNA-A in the resistant LAM 144R and susceptible LAM 144S isolines. Quantification of viral load was performed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) using primers specific for the coat protein (CP1). Data was analyzed by nonparametric Kruskal-Wallis test. The viral titer was significantly lower in plants LAM 144R compared to the LAM 144S, showing 2 times lower viral load in the resistant line at tenth day after agroinfiltration. To evaluate the effect of this gene on the long-distance movement of Tomato chlorotic mottle virus (ToCMoV) in the near isogenig lines LAM 144R and LAM 144S, double grafts were performed. Plants LAM 144S (susceptible) were inoculated with ToCMoV. Double grafts were performed using as grafts LAM 144R or LAM 144S segments and as overgrafts, LAM 144S plants. Samples were collected at different times ToCMoV was detected by PCR and Southern blot showing a restriction in long-distance viral movement when plants LAM 144R containing the Ty-1 gene was used as grafts. The results of this study demonstrate that LAM 144-R can be considered promising for the use in breeding programs for the development of new resistent cultivars to different Begomovirus species.