Imobilização de enzimas na parede celular de Saccharomyces cerevisiae para produção de etanol a partir de amido

Abstract

A utilização da biomassa tem se tornado uma atrativa fonte alternativa para a produção de energia. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado na indústria de fermentação alcoólica, porém não possui atividade amilolítica. Portanto, a modificação genética dessa levedura vem sendo feita para obteção de novas linhagens amilolíticas. O presente trabalho teve como objetivo a construção de um vetor de expressão de proteínas heterólogas na superfície de S. cerevisiae para coexpressar a enzima α-amilase de Bacillus subtilis juntamente com a glicoamilase de Aspergillus awamori na parede celular da levedura. Para ancorar as proteínas de interesse à parede foi feita a fusão destas com a região C-terminal da α-aglutinina da própria levedura, contendo a sequencia sinal para adição da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e as proteínas expressas na linhagem MFL. Utilizou-se três formas diferentes de glicoamilase, uma contendo o gene completo (gla1), outra apenas com o domínio catalítico e a região altamente O- glicosilada (gla2) e uma última com domínio catalítico e parte da região O- glicosilada (gla3). Os testes de atividade mostraram que a enzima α-amilase aderiu à parede celular, porém a maior parte da proteína produzida ainda era secretada para fora da célula. As maiores atividades encontradas para as construções contendo α-amilase fusionada à porção C-terminal da α-aglutinina foi de 0,99 ± 0,02 U/mL e 89,43 ± 5,27 U/mL, associada à célula e no sobrenadante, respectivamente. A secreção da α-amilase para o meio de cultura apresentou grande aumento quando fusionada a outra proteína. A atividade observada para glicoamilase também foi maior no sobrenadante de cultura. As três diferentes formas de glicoamilase fusionadas à α-aglutinina não apresentaram diferenças significativas de expressão entre si. A análise do perfil secretório mostrou que as enzimas fusionadas encontradas no sobrenadante de cultura apresentam a mesma massa molecular da enzima secretada sem fusão alguma. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Biomass has become an attractive alternative source for energy production. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most used microorganism in industrial fermentation, however it doesn’t have amylolytic activity. Therefore, molecular engineering of this yeast have been done to obtain new amylolytic strains. The aim of this work was to construct a vector for expression of heterologous proteins on the cell surface of S. cerevisiae to coexpress the α-amylase from Bacillus subtilis and the glucoamylase of Aspergillus awamori in the yeast cell wall. To anchor the proteins to the wall, they were fused with the C-terminal region of α-agglutinin containing the signal sequence for addition of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor and the protein produced expressed in the MFL strain. We used three different forms of glucoamylase: one containing the complete gene (gla1), another with only the catalytic domain and the highly-glycosylated region (gla2) and the last one with a catalytic domain and part of the O-glycosylated region (gla3). The activity tests showed that the enzyme α-amylase was attached to the cell wall, but most of the produced protein was secreted to the culture medium. The highest activities found for the constructs containing α-amylase fused to the C-terminal region of α-agglutinin was 0,99 ± 0,02 U/mL and 89,43 ± 5,27 U/mL, to pellet and supernatant, respectively. The secretion of α-amylase protein was greatly increased when fused to another protein. The activity found for glucoamylase was also higher in the culture supernatant. The three different forms of glucoamylase fused to C-terminal region of α-agglutinin showed no significant differences in expression among them. The secretory analysis showed that merged enzymes found in the culture’s supernatant presented the same molecular mass as the enzyme secreted without any fusion.