Análise de proteínas nucleares reguladas na amastigogênese e de complexos proteicos de Trypanosoma Cruzi

Abstract

Uma característica do Trypanosoma cruzi são as mudanças morfológicas que ocorrem durante seu ciclo de vida. A amastigogênese é um importante processo no ciclo de vida do parasita onde as formas tripomastigotas infectivas se diferenciam em amastigotas replicativas. A duplicação celular é um processo complexo, onde vários eventos estão envolvidos, dentre eles, a correta segregação das cromátides irmãs após a replicação do DNA, função exercida por um complexo denominado coesina. Neste trabalho, foi proposta caracterização de complexos proteicos de T.cruzi assim como a identificação de proteínas de complexos nucleares, cuja expressão se altera durante a amastigogênese. Por meio da técnica Blue Native PAGE (BN-PAGE) foi possível realizar a separação de complexos proteicos de lisado total das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Os componentes individuais dos complexos puderam ser visualizados em segunda dimensão após o gel ter sido corado com nitrato de prata. Experimentos de detecção imunológica por western blotting demonstraram a ausência da subunidade SCC1 do complexo coesina em amastigotas gerados por diferenciação in vitro de formas tripomastigotas em cultura axênica em pH 5. Porém, a subunidade SCC1 pode ser detectada em extratos proteicos de formas amastigotas que foram reincubadas por 10 h em meio de cultura com pH ajustado para 7,5, sugerindo que essas formas são capazes de manter suas propriedades replicativas. Por espectrometria de massas do tipo LC-MS/MS, 1.339 proteínas de T. cruzi foram identificadas de amostras provenientes dos ensaios de amastigogênese. Destas, 560 proteínas foram anotadas em bancos de dados como proteínas reguladas, 65 possuíam localização nuclear e 66 foram preditas como pertencentes a complexos proteicos. Na classificação das proteínas identificadas os grupos que correspondem àqueles envolvidos em metabolismo de ácidos nucleicos aparecem como predominantes. Proteínas que se ligam a DNA (9,23%), proteínas de ligação a RNA (13,85%) e proteínas que se ligam a nucleotídeos (18,46%) correspondem juntas a 41,54% do total de proteínas nucleares reguladas, corroborando o fato de que intensa atividade de transcrição e processamento de DNA e RNA ocorre em todas as etapas de diferenciação, além de outros principais grupos como as peptidases (15,38%), proteínas estruturais (13,85%) e atividade de hidrolases (12,31%). Para proteínas reguladas e envolvidas com complexos proteicos durante a amastigogênese os maiores grupos estão envolvidos em processos de transporte (25,58%), processos metabólicos (19,77%), processos metabólicos de compostos contendo nucleotídeos (16,28%), geração de precursores metabólicos e de energia (8,14%). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

A feature of Trypanosoma cruzi is the morphological changes that occur during their life cycle. The amastigogenesisis an important process in the life cycle of the parasite where the infective trypomastigotes differentiate into replicative amastigotes. A cell replication is a complex process, where several events are involved, among them the correct segregation of sister chromatids after DNA replication, function performed by a complex called cohesin. In this work we proposed the characterization of T. cruzi protein complexes and the identification of proteins from nuclear complexes, whose expression is altered during amastigogenesis. Through the technique of Blue Native PAGE (BN-PAGE) it was possible the separation of protein complexes from total lysate of T. cruzi epimastigotes. The individual components of the complexes could be visualized after the second dimensional gel after stainingwith silver nitrate. Immunological detection experiments by western blotting demonstrated the absence of SCC1 subunit of cohesin complex in amastigotes generated by in vitro differentiation of trypomastigotes in axenic culture at pH 5.0. However, the subunit SCC1 was detected in protein extracts of amastigotes that were reincubated for 10 hours in a culture medium adjusted at pH 7.5, suggesting that these forms are able to maintain their replicative properties. By LC-MS/MS mass spectrometry, 1,339 proteins ofT.cruzi were identified in samples from mastigogenesis. Of these, 560 proteins were annotated in databases as regulated proteins, 65 have presented nuclear localization and 66 were predicted as belonging to protein complexes. In the classification of proteins involved in nucleic acid metabolism, this group appears to be predominant. Proteins which bind to DNA (9.23%), RNA-binding proteins (13.85%) and proteins that bind nucleotides (18.46%) correspond together to 41.54% of the total regulated nuclear proteins, confirming that strong transcription activity and DNA and RNA processing occur in all stages of differentiation, and other major groups such as peptidases (15.38%), structural proteins (13.85%) and activity of hydrolases (12.31%). For regulated proteins and protein complexes involved in amastigogenesis the largest groups are involved in transport processes (25.58%), metabolic processes (19.77%), metabolic processes of compounds containing nucleotides (16.28%), generation of metabolic precursors and energy (8.14%).