Diversidade molecular no proteoma e peptidoma da saliva de triatoma infestans

Abstract

A doença de Chagas, doença tropical negligenciada, tem como agente etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi e como um dos principais vetores o triatomíneo hematófago Triatoma infestans. Em sua saliva é possível encontrar moléculas biologicamente ativas que viabilizam o repasto sanguíneo. Nesse trabalho, caracterizamos o peptidoma salivar do T. infestans, conjunto de peptídeos secretados na saliva com massa molecular menor que 10 kDa. A saliva secretada por T. infestans adultos foi coletada na ausência de inibidores de proteases. Após a quantificação, a integridade proteica das moléculas foi conferida por eletroforese unidimensional. Em seguida, por peptide mass fingerprinting, peptídeos com massa molecular de até 7.000 Da foram detectados na saliva. A saliva foi fracionada por centrifugação em microconcentradores com membrana de exclusão molecular de 10 kDa na presença de inibidores de proteases, gerando duas frações: 1) retida, contendo os polipeptídeos de massa molecular superior a 10 kDa; e 2) filtrada, contendo os peptídeos. A primeira foi analisada por gel eletroforético bidimensional e a segunda por nanoLC-MS/MS usando LTQ XL-Orbitrap (ThermoFisher Scientific), sem digestão tríptica in vitro. A análise por nanoLC-MS/MS foi repetida após digestão tríptica em solução e dessalinização em micro-coluna de C18. Ferramentas de bioinformática foram usadas para análise das sequências. No total, foram identificadas 234 proteínas. 164 foram encontradas na fração retida, sendo 130 com função já conhecida na alimentação sanguínea. Na fração filtrada, das 70 sequências identificadas, oito têm uma massa molecular predita < 10 kDa e as outras 62 são fragmentos da proteólise de proteínas maiores. Por análises de bioinformática, observamos que 171 das proteínas apresentam peptídeo sinal de via clássica de secreção, e as demais, com exceção de três, são preditas como secretadas por vias não clássicas. Para concluir, a primeira análise peptidômica da saliva de triatomíneo mostrou que a saliva de T. infestans é rica em peptídeos. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Chagas disease, a Neglected Tropical Disease, is caused by the protozoan parasite Trypanosoma cruzi, which is transmitted by insect vectors. Triatoma infestans is one of the main vectors of the disease. As other disease vectors, it is a hematophagous insect. Feeding behavior implies the production of biologically active molecules in saliva capable of inhibiting hemostasis, inflammatory and immune responses. At the present study, we conducted a broad analysis of the proteome and peptidome, the latter comprises the set of peptides with a molecular weight under 10 kDa, of the saliva of T. infestans. Saliva was collected from insect adults in the absence of protease inhibitors. After protein quantification, the integrity of the proteins were analyzed by polyacrylamide-SDS gel electrophoresis. After that, by peptide mass fingerprinting, we detected peptides with molecular weight up to 7.000 Da. The saliva was then fractionated in the presence of a cocktail of protease inhibitors using a 10 kDa cut-off membrane. Two fractions were obtained: the retained (>10 kDa) and the filtrate (<10 kDa) fractions. The first was submitted to 2-DE electrophoresis, and the latter to nanoLC-MS/MS with reverse-phase high- performance liquid chromatography coupled with a high throughput LTQ XL- Orbitrap mass spectrometer (ThermoFisher Scientific), in the absence of tryptic digestion in vitro. The nanoLC-MS/MS analysis was repeated after in-solution tryptic digestion and desalinization in C18 microcolumn. A total of 234 proteins were identified. 164 proteins were found in the retained fraction, among which 130 have known functions. In the filtrate fraction, among 70 sequences identified, eight have predicted molecular weight lower than 10 kDa, and the other 62 were proteolytic fragments of higher molecular weight proteins. Bioinformatic analysis revealed that 171 proteins present signal peptides, three were not predicted to be secreted, and the other are secreted through non-classical pathways. In conclusion, the first peptidomic analysis of a triatomine bug saliva showed that T. infestans saliva is plenty of peptides.