Clonagem, análise da seqüência do gene p74 e filogenia de um novo vírus isolado da lagarta-do-álamo Condylorrhiza vestigialis

Abstract

Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CvMNPV) é um baculovirus patogênico a lagartas de Condylorrhiza vestigialis (Guenée, 1854) (Lepidoptera: Crambidae), uma praga de uma espécie florestal, conhecida como Álamo (Populus spp., Salicaceae), de considerável importância econômica. Este baculovirus foi recentemente identificado e pouca informação pertinente à sua taxonomia tem sido relatada. No estudo apresentado, o gene p74 de CvMNPV foi identificado, seqüenciado, e sua relação filogenética com outros baculovirus estimada. O gene p74 codifica uma proteína altamente conservada e é essencial para a infectividade do ODV. A detecção do gene p74 de CvMNPV foi feita usando hibridização Southern blot dos produtos do DNA genômico clivados com as enzimas de restrição HindIII, PstI e EcoRI com uma sonda radioativa de DNA obtida a partir da amplificação parcial do gene p74 por PCR. Dois fragmentos de restrição e um produto de PCR da região terminal do gene p74 foram clonados nos plasmídeos pBluescript II KS+ (Stratagene) e pGEM-T Easy (Promega), respectivamente. Utilizando-se ferramentas de bioinformática, a análise dos resultados do sequenciamento nucleotídico possibilitou a identificação da ORF p74 de 1935 pb (nº de acesso EU919397 no GenBank/EMBL) que codifica potencialmente um polipeptídeo de 644 aminoácidos de 73,6133 kDa e ponto isoelétrico de 5,1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos P74 deduzida de CvMNPV com homólogas de baculovirus revelou a presença de quatro domínios conservados: dois domínios P74 relacionados à infectividade oral e dois domínios transmembrânicos na região Cterminal. Os domínios P74 hipoteticamente estão expostos na surperfície do envelope e interagem com receptores específicos na membrana plasmática da célula hospedeira. Os domínios transmembrânicos são responsáveis pela inserção da proteína na membrana do envelope do ODV. A seqüência de aminoácidos P74 deduzida de CvMNPV potencialmente sofre modificações pós-traducionais do tipo glicosilação, fosforilação e miristilação e apresenta como estrutura secundária predominante a α–hélice. A análise filogenética baseada na seqüência nucleotídica do gene p74 de CvMNPV e na sua seqüência de aminoácidos deduzida manteve a divisão da família Baculoviridae nos quatro grupos descritos em estudos similares (NPV específicos de lepidópteros, GV específicos de lepidópteros, NPV específicos de himenópteros e NPV específicos de dípteros) e forneceu dados consistentes para confirmar que o CvMNPV pertence ao Grupo I dos NPV, e que o CvMNPV é mais proximamente relacionado com Choristoneura fumiferana defective NPV. Estes resultados constituem uma importante contribuição para a caracterização deste novo vírus (CvMNPV), o qual possui grande potencial para o controle biológico de lagartas Condylorrhiza vestigialis. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT

Condylorrhiza vestigialis multiple nucleopolyhedrovirus (CvMNPV) is a baculovirus pathogenic to Condylorrhiza vestigialis caterpillars (Guenée, 1854) (Lepidoptera: Crambidae), a pest of a forest species known as Poplar (Populus spp., Salicaceae) of considerable economic importance. This baculovirus was recently identified and few informations pertaining to its taxonomy has been reported. In the present study, the p74 gene from CvMNPV was identified, sequenced and its phylogenetic relationship with other baculoviruses estimated. The gene p74 encodes a protein that is highly conserved among all sequenced baculoviruses and is essential for ODV infectivity. The detection of CvMNPV p74 gene was done using Southern blot hybridization from genomic DNA digested with the restriction endonucleases HindIII, PstI, EcoRI and a radioactive DNA probe resulting from partial amplification of the p74 gene by PCR. Two DNA restriction fragments and a PCR product from terminal region of p74 gene were cloned in pBluescript II KS+ (Stratagene) and pGEM-T Easy (Promega) plasmids respectively. By using bioinformatics tools, the nucleotidic sequence analysis possibilited the identification of the p74 ORF of 1935bp (GenBank/EMBL accession number EU919397) that potentially encodes a polypeptide of 644 amino acids with predicted molecular mass of 73.6133 kDa and an isoelectric point of 5.12. The alignment of the CvMNPV P74 deduced amino acid sequence with other homologous baculoviruses revealed the presence of four conserved domains: two P74 domains related to oral infectivity and two transmembrane domains in the C-terminal region. The P74 domains are hypothetically exposed outside of ODV envelopes and attach with specific receptors present in the host cell plasma membrane. The transmembrane domains are responsible by anchored within of ODV envelope. The CvMNPV deduced amino acid sequence potentially undergoes post-translational modifications as glycosylation, phosphorylation and myristoylation and present α-helix as secundary structure. Phylogenetic analysis based on the CvMNPVp74 deduced amino acid and nucleotide sequences maintained the division of the Baculoviridae family in the four groups described in similar studies (lepidopteran-specific NPV, lepidopteran-specific GV, hymenopteran-specific NPV and dipteran-specific NPV) and provided consistent data to affirm that the CvMNPV baculovirus belongs to the lepidopteran NPV Group I, and that the CvMNPV is most closely related with Choristoneura fumiferana defective NPV (CfDEFNPV). These results constitute an important contribution to characterization of this new virus (CvMNPV) which has a high potential for biological control of Condylorrhiza vestigialis caterpillars.