Perfil de metilação do éxon 1 do gene XIST em células da linhagem espermatogênica de bovinos

Abstract

Embriões de mamíferos sofrem duas ondas de reprogramação, uma no zigoto, onde os genomas maternos e paternos são desmetilados e em seguida metilados de novo, e outra nas células germinativas primordiais. Acredita-se que a metilação de novo nas células germinativas masculinas esteja estabelecida ainda antes do nascimento, no entanto, como e quando esse processo ocorre em bovinos ainda não foi estabelecido. Sendo assim, este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de verificar se há reprogramação epigenética durante a espermatogênese através da avaliação do perfil de metilação da região do éxon 1 do gene XIST em diferentes células espermáticas. Foram utilizados espermatócitos, espermátides alongadas e espermatozóides da cabeça e cauda do epidídimo coletados de testículos obtidos em abatedouro. As células coletadas tiveram o seu DNA extraído e em seguida tratado com bissulfito de sódio. O DNA tratado foi amplificado através de PCR nested, e o produto amplificado foi inserido em um vetor e clonado em bactérias. O DNA plasmidial foi extraído e sequenciado. As sequências do experimento foram comparadas com a sequência do gene XIST depositada no GenBank, e aquelas que apresentaram taxa de conversão do bissulfito de sódio ≥95% e homologia ≥97% com a sequência do GenBank foram utilizadas. Para a comparação do nível de metilação entre os grupos foram utilizados os testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, com nível de significância de P<0,05. O grupo dos espermatócitos, espermátides alongadas, espermatozóides de cauda e cabeça de epidídimo apresentaram 15,70%±14,54, 1,96%±1,96, 74,09%±6,78 e 45,09%±20,19 de metilação, respectivamente, sendo que o grupo da cabeça de epidídimo apresentou-se mais metilado do que os grupos espermatócitos e espermátides alongadas (P<0,01). Quando foram formados e comparados dois grupos, um com espermatócitos e espermátides alongadas, e outro com espermatozoides de cabeça e cauda de epidídimo, a análise mostrou haver diferença entre eles (P<0,01) com relação a percentagem de metilação. Os resultados sugerem que a reprogramação epigenética em bovinos ainda está ocorrendo durante a formação do espermatozóide. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT

Mammalian embryos undergo two waves of genome reprogramming, the first in the zygote, when paternal and maternal genomes are demethylated and, just after, re-methylated, and the second in the primordial germ cells. It is believed that re-methylation is reestablished in male germ cells before birth, however, it is not clear when and how this process occurs in bovine. Thus, this work aimed to verify if there is epigenetic reprogramming during spermatogenesis through the evaluation of the methylation profile of XIST gene exon 1 in different spermatogenic cells. Spermatocytes, elongated spermatids and spermatozoa from epididymis head and tail were collected from bovine testes obtained from a slaughterhouse. The collected cells had their DNA extracted and treated with bisulfite. The treated DNA was amplified through nested PCR, and the product was inserted on a vector and cloned in bacteria. The plasmidial DNA was extracted and sequenced. The sequences of the experiment were compared with the sequence of gene XIST from the GenBank and those that presented bisulfite conversion rate of ≥95% and homology of ≥97% with the sequence from GenBank were utilized. To compare the methylation level between the groups Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests were used, with significance level of P<0.05. The spermatocytes, elongated spermatids and spermatozoa from epididymis head and tail groups presented 15.70%±14.54, 1.96%±1.96, 74.09%±6.78 and 45.09%±20.19 of methylation respectively. The epididymis head group was more methylated then spermatocytes and elongated spermatids groups (P<0.01). When arranged in two groups, one with spermatocytes and elongated spermatids, and another with epididymids spermatozoa, and compared, it was observed that the methylation level was different (P<0.01) between them. These results suggest that epigenetic reprogramming is still occurring during spermatozoa formation.