Inibição e reversão da maturação nuclear, avaliação da maturação citoplasmática e produção de esteróides em complexos cumulus oophorus bovinos co-cultivados com hemi-secções foliculares em meio de cultura definido

Abstract

O presente trabalho teve o objetivo de padronizar um protocolo de pré-maturação, onde complexos cumulus oophorus (COCs- do inglês cumulus oocyte complex) bovinos imaturos são co-cultivados com hemi-secções foliculares (HS) em meio definido (α-MEM+PVA). No experimento 1 foi avaliado, o efeito deste co-cultivo pelo período de 24 horas na manutenção do estágio imaturo dos COCs. Os grupos experimentais avaliados foram: G1=TCM- 199+SFB+COCs; G2=TCM-199+SFB+HS+COCs; G3=α-MEM+PVA+COCs; G4=α- MEM+PVA+HS+COCs. No experimento 2, foi feita a avaliação do potencial de reversibilidade do processo inibitório após a pré-maturação, cultivando os COCs previamente pré-maturados em meio de maturação padrão (TCM-199+SFB). Os meios de cultivo destes experimentos foram armazenados a –20° C para posterior dosagem dos hormônios estradiol (E2) e progesterona (P4) com a utilização de kits de radioimunoensaio. Em média 4 COCs de cada tratamento dos experimentos 1 e 2 foram processados para análise da maturação citoplasmática ao microscópio eletrônico de transmissão. Os resultados do experimento 1 mostram que, os tratamentos G2, G3 e G4 foram efetivos na inibição da progressão da meiose, com respectivamente 81,2; 74,0 e 96,3% dos COCs imaturos. O tratamento G1 (controle) apresentou ao final do tempo de cultivo 83,1% de COCs maduros; P<0,05. No experimento 2, somente os grupos G1 e G3 apresentaram mais de 80% de oócitos maduros ao final das 24 horas de cultura em meio padrão. Os grupos G2 e G4 apresentaram apenas 29,1 e 16,3% respectivamente dos COCs maduros ao final do cultivo; P<0,05. A dosagem dos hormônios esteróides mostrou no experimento 1, que o grupo G3 apresentou a maior produção de E2 (2444,24 pg/mL) e menor produção de P4 (3,47 ng/mL); P<0,0001. A produção de P4 foi máxima no grupo G2 (77,87 ng/mL). A presença das HS promoveu o aumento da produção deste hormônio nos grupos G2 e G4. No experimento 2, a concentração de E2 foi maior no grupo pré-maturado em meio definido, assim como a concentração de P4, que foi significativamente maior neste tratamento (G3), 42,82 ng/mL; P< 0,0032. A análise ultraestrutural dos COCs mostrou que a presença das HS (grupos G2 e G4) provoca a morte destes ainda no período de pré-maturação. No grupo G3, foi observado que o meio de cultivo α-MEM+PVA promoveu o início da maturação citoplasmática durante a pré-maturação. No experimento 2, este processo foi completado após o cultivo em meio de maturação padrão. Conclui-se portanto que o meio de cultura α-MEM+PVA fornece um ambiente adequado para que os COCs sofram a pré-maturação, já que a relação E2:P4 neste sistema é condizente com a fase em que os COCs se encontram, além de que este meio propicia uma alta taxa de inibição da maturação nuclear seguida de uma grande porcentagem de reversão desta inibição. Outro fato importante foi que a maturação citoplasmática foi iniciada ainda no período de prématuração, e chegou a termo durante a maturação in vitro. O co-cultivo com HS, no entanto, não gerou resultados promissores. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT

This study aimed to standardize a physiological protocol of pre- maturation, where immature bovine cumulus oocyte complex (COCs) are co-cultured with follicular hemissections (HS) in defined medium (α-MEM + PVA). In the first experiment it was evaluated, the effect of this co-culture for the period of 24 hours in the maintenance of COCs’ immature stage. The following experimental groups evaluated were: G1=TCM-199 +FCS+COCs; G2=TCM- 199+FCS+HS+COCs; G3=α-MEM+PVA+COCs; G4=α-MEM+PVA+HS+COCs. The experiment 2 was performed to assess the reversibility potential of the inhibitory process after the pre-maturation. COCs previously pre-matured were cultured in standard medium of maturation (TCM-199 + SFB). The culture medium of these experiments were stored at -20° C for later dosage of hormones estradiol (E2) and progesterone (P4) with radioimmunoassay kits. On average 4 COCs of each treatment of experiments 1 and 2 were processed for cytoplasmic maturation analysis at the transmission electron microscope. The results of the experiment 1 show that the treatments G2, G3 and G4 were effective in maintain meiotic arrest, with 81.2, 74.0 and 96.3% respectively of immature COCs. Treatment G1 (control) showed at the end of culture 83.1% of mature COCs, P <0.05. In experiment 2, only the groups G1 and G3 showed more than 80% of mature oocytes at the end of 24 hours of culture in the medium standard. The groups G2 and G4 had only 29.1 and 16.3% respectively of the mature COCs at the end of the culture, P<0.05. The dosage of steroid hormones in Experiment 1 showed that the G3 had the highest production of E2 (2444.24 pg / mL) and lower production of P4 (3.47 ng / mL), P <0.0001. The production of P4 was the highest in group G2 (77.87 ng / mL). Due the presence of HS there was an increasing production of this hormone in groups G2 and G4. In experiment 2, the concentration of E2 was higher in group pre-matured in defined medium, as well as the concentration of P4, which was significantly higher in this treatment, 42.82 ng / mL, P<0.0032.The ultrastructural analysis of the COCs showed that the presence of HS (groups G2 and G4) causes the cellular death still in the prematuration culture. In group G3, it was observed that the medium α-MEM + PVA promoted the beginning of the cytoplasmic maturation during the pre-maturation. In experiment 2, this process has been completed after culture in standard maturation medium. It comes to the conclusion that the culture α-MEM + PVA provides a suitable environment for the COCs suffer a pre-maturation, as the relationship E2: P4 in this system is consistent with the stage in which the COCs are. In addition, this system provides a high rate of inhibition of nuclear maturation followed by a large percentage of reversal of this inhibition. Another important fact is that the cytoplasmic maturation began still in the prematuration period, and finished during in vitro maturation. The co-culture with HS, didn’t generate promising results.