Desenvolvimento de um sistema de genética reversa para tospovírus via moléculas de RNA defectivo-interferente (DI-RNA)

Abstract

O gênero Tospovirus agrupa importantes vírus vegetais pertencentes à família Bunyaviridae. Estes são vírus de ssRNA(-) com genoma tripartido para o qual ainda não existe um sistema de estudo baseado em genética reversa. A genética reversa é uma ferramenta investigativa com aplicações importantes para o estudo da expressão gênica, evolução e interação vírus-hospedeiro através da manipulação do RNA viral por meio de seu DNA complementar (cDNA). O desenvolvimento de sistemas de genética reversa para vírus vegetais de ssRNA(-), no entanto, ainda precisa superar barreiras técnicas relativas à manutenção e cultivo de células vegetais e produção e transfecção de clones infecciosos, em contraste aos estudos desenvolvidos para vírus animais. O capítulo 1 discorre sobre sistemas de genética reversa e o conhecimento e aplicação dos RNAs defectivos-interferentes virais (DIs), enfatizando o estado da arte, em especial sob a perspectiva dos tospovírus. No capítulo 2, a busca por novos DIs a partir de um isolado brasileiro de tospovírus levou à publicação da sequência completa e caracterização molecular do RNA L de Tomato chlorotic spot virus (TCSV). Estudos de evolução molecular utilizando a proteína L como critério taxonômico indicam melhor poder de resolução e maior confiabilidade na descrição da evolução do gênero Tospovirus em comparação a filogenia baseada na proteína N. Portanto, o L RNA poderia ser usado como critério alternativo e/ou complementar ao gene N na taxonomia de tospovirus. O capítulo 3 apresenta os resultados preliminares do desenvolvimento de uma estratégia alternativa a construção de clones infecciosos para tospovírus baseada no estudo das propriedades replicativas e de expressão de mini-genomas derivados de RNAs defectivos-interferentes transcritos in planta pela expressão transiente da enzima T7 RNA Polimerase e incorporados ao ciclo de replicação de um vírus auxiliar livre de DIs, avaliados por Northern Blotting. Os resultados iniciais parecem demonstrar que esta estratégia é promissora, pois foi possível detectar transcrição de DIs in planta pelo sistema T7 Polimerase. No entanto, a estratégia deve ser otimizada para seu emprego com ferramenta para o estudo de genética reversa no gênero Tospovirus. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT

The genus Tospovirus comprises important plant pathogens belonging to the Bunyaviridae family of tripartite ssRNA(-) genome viruses for which a reverse genetics system is still unavailable. Reverse genetics is an important methodological tool for the study of gene expression, evolution and host-virus interactions based on the ability of manipulating viral RNA genomes through its DNA counterparts (cDNA). Though significant progress has been achieved for animal-infecting viruses, the same is not true to plant viruses since important technical barriers have not yet been overcome, such as the in vitro maintenance and growth of plant cells and the transfection efficiency of infectious clones. In chapter 1 a review of the acquired knowledge and state of the art of reverse genetics and defective-interfering RNAs/particles with further insight into the Tospovirus genus is presented. Chapter 2 describes how the search for new defective-interfering (DI) RNAs resulted in the publication of the complete sequence and molecular characterization of the L RNA of Tomato chlorotic spot virus (TCSV). In this chapter, the molecular evolution analysis of the Tospovirus genus based on L protein phylogeny is shown to provide higher resolution and confidence values for the evolutionary history of the Tospovirus, rather than N protein based analysis. Therefore, the L gene could be used as an alternative and/or additional parameter in the taxonomy of the Tospovirus genus. Chapter 3 presents the preliminary results on the development of a reverse genetics systems for the tospoviruses based not on the construction of infectious cDNA clones, but on the replication and expression of DI-derived mini-genomes via in planta T7 RNA Polymerase-dependent transcription and helper virus infectious cycle incorporation. The preliminary results showed that the T7 polymerase system was able to transcribe DI molecules. However, the strategy needs to be optimized to be employed as a tool for studying reverse genetics in the Tospovirus genus