Validação doTeste de Elisa com exoantígenos e da imunofluorescência direta para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana

Abstract

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é um problema de saúde pública, cujo diagnóstico depende dos diversos métodos empregados em conjunto, na busca de obter melhor sensibilidade e especificidade. O objetivo do presente estudo foi validar a técnica de ELISA empregando exoantígenos (ELISA exoAg) de Leishmania mexicana e a técnica de Imunofluorescência Direta (IFD) para o diagnóstico da LTA em amostras de pacientes atendidos no Ambulatório de Dermatologia do Hospital Universitário de Brasília. O projeto incluiu 106 pacientes portadores de leishmaniose tegumentar americana atendidos entre os anos de 2007 e 2010, cuja confirmação da infecção ocorreu por critérios clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. Foi realizada a coleta de amostra sanguínea e de fragmento de lesão de tecido cutâneo na fase pré-tratamento. Os soros foram armazenados a -20ºC e o fragmento de lesão foi comprimido sobre uma lâmina de vidro em 6 pontos e a lâmina foi fixada com acetona em banho de gelo. O teste de ELISA com Exo-Ag foi realizado com soros prédiluídos proporção 1:100. Os resultados demonstraram que houve predomínio da forma cutânea (84,9%) e apenas 15,1% de casos na forma mucosa. Os casos de infecção pela primeira vez somaram maioria (83%) contra 11% de recidivas. O ELISA exo-Ag demonstrou sensibilidade de 90,8 5,7% (n = 98; IC 95%). Em grupo controle composto por pacientes aparentemente sadios a especificidade do ELISA exo-Ag foi de 91,3 6,2% (n = 80; IC 95%). Quanto à especificidade, em amostras de pacientes portadores de diversas doenças: doença de Chagas: 66,7 18,8% (n = 24; IC 95%); em amostras de portadores de doenças reumáticas: 42,4% 16,9% (n = 33; IC 95%); pênfigo foliáceo: 76,9 ± 22,9% (n = 13; IC 95%); hanseníase virchowiana: 85,7 ± 24,2% (n = 8; IC 95%); soros com reação VDRL positivas: 87,5 ± 15,7% (n = 16; IC 95%); e micoses profundas: 77,8 ± 27,4% (n = 9; IC 95%). O ELISA exo-Ag obteve valor preditivo positivo de 73,5 ± 8,8% (n = 96), negativo de 93,3 ± 5,4 (n = 81)% e acurácia de 87,6%. A IFD, por sua vez, apresentou sensibilidade de 72,2 ± 10,4% (n = 72; IC 95%) e em amostras de pacientes com lesão cutânea, mas não portadores de LTA, a especificidade foi de 96,3 ± 5,0% (n = 55; IC 95%), garantindo valor preditivo positivo de 96,3 ± 4,3 (n=79), negativo de 72,6 ± 10,1% (n=75) e acurácia de 82,7%. A PCR-RFLP verificou presença de subgênero Viannia na maior parte das amostras indicando tratar-se da espécie L. V. braziliensis. A avaliação dos custos verificou que os dois métodos propostos custam 40 % mais que o conjunto de técnicas de rotina, por paciente. Por outro lado, a análise dos resultados dos testes propostos, de forma concomitante, demonstrou aumento na sensibilidade e na especificidade, com a vantagem da rapidez do resultado. Os resultados demonstraram bom desempenho do ELISA exo-Ag e da IFD, e validaram as 2 técnicas propostas para o diagnóstico de LTA causada por L. braziliensis. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT

American Cutaneous leishmaniasis (ACL) is a public health problem whose diagnosis depends on the various methods used together in the quest to get better sensitivity and specificity. The purpose of this study was to validate the ELISA technique employing exoantigens (ELISA exoAg) of Leishmania mexicana and direct immunofluorescence (DIF) for the diagnosis of ACL. in samples from patients at the Clinic of Dermatology, University Hospital of Brasília. The project included 106 patients with cutaneous leishmaniasis treated between the years 2007 and 2010, whose infection was confirmed by clinical, epidemiological and laboratory. We collected blood sample and a fragment of skin tissue injury in the pre-treatment. Sera were stored at -20º C and fragment of lesion was compressed on a glass slide in six points. The blade was fixed with acetone in ice bath. The ELISA with Exo-Ag was carried out with sera pre-diluted 1:100 ratio. The results showed a predominance of cutaneous form (84.9%) and only 15.1% of cases in the mucosal form. The new cases totaled majority (83%) against 11% of recurrences. The exo-Ag ELISA showed sensitivity of 90.8 6.2% (n = 98, CI 95%). In control group of apparently healthy patients, the specificity of exo-Ag-ELISA was 91.3 5,7% (n = 80; CI 95%). For specificity, we tested sera from patients with various diseases: patients with rheumatic diseases: 42.4 16.9% (n = 33; CI 95%); Chagas' disease: 66.7 18.8% (n = 24, CI 95%); pemphigus foliaceus: 76.9 ± 22.9% (n = 13, CI 95%), hanseniasis: 85.7 ± 24.2% (n = 8, CI 95%); patients with VDRL positive test: 87.5 ± 15.7% (n = 16, CI 95%) and deep mycoses: 77.8 ± 27.4% (n = 9, CI 95%). The exo-Ag ELISA obtained positive predictive value of 73.5 ± 8,8% (n = 96; CI 95%), negative predictive value of 93.3 ± 5,4% (n = 81; CI 95%) and 87.6% of accuracy. The DIF, showed sensitivity of 72.2 ± 10.4% (n = 72, CI 95%) and specificity was 96.3 ± 5.0% (n = 55, CI 95%) in samples from patients with skin lesions (but not patients with ACL), ensuring positive predictive value of 96.3 ± 4,3% (n = 79; CI 95%), negative predictive value of 72.6 ± 10,1 (n = 75; CI 95%) and accuracy of 82.7%. The PCR-RFLP found Viannia subgenus of most of the samples, that indicated the presence of the species L. V. braziliensis. The evaluation found that the two proposed methods cost 40% more than the set of routine, per patient. However, the analysis of the results of the proposed tests, concomitantly, showed an increase in sensitivity and specificity, with the advantage of less time to finish. The results showed good performance of the exo-Ag ELISA and DIF, and validated the two proposed techniques for the diagnosis of ACL caused by L. braziliensis.