Estudo dos eventos iniciais da infecção humana por Leishmania braziliensis em explantes de pele humana

Abstract

As leishmanioses são um grupo de doenças de grande relevância para a saúde pública, sendo causadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitidas pela picada do flebotomíneo. Apesar dos avanços nos estudos sobre a imunobiologia da infecção, os mecanismos iniciais da interação parasitohospedeiro ainda não são completamente compreendidos, e, embora modelos in vitro e in vivo sejam a base para a geração de novos conhecimentos no assunto, nenhum reproduz fielmente a infecção humana. Modelos ex vivo, como os explantes de pele humana, representam uma alternativa promissora para esses estudos, pois preservam a complexidade estrutural e celular do tecido cutâneo, incluindo células imunológicas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi padronizar o uso de culturas organotípicas de explantes de pele humana (do inglês, human organotypic skin explant cultures - hOSEC) como modelo experimental para o estudo da infecção por Leishmania braziliensis. A viabilidade dos fragmentos foi determinada por meio de avaliação metabólica (ensaio de metabolização do sal TTC) e estrutural (avaliação histológica) da pele. A presença de células imunes nas peles foi determinada por meio de imunohistoquímica. A infecção por L. braziliensis foi padronizada e determinada em 3 x 105 parasitas por fragmento de pele, inoculados por meio de 3 injeções de 5 uL cada. A presença do parasita foi confirmada diretamente a partir da visualização dos parasitas em cortes histológicos e microscopia eletrônica de varredura. Molecularmente, a carga parasitária foi quantificada ao longo do período de cultivo por meio de qPCR. Por fim, as consequências da presença dos parasitos foram determinadas por meio de avaliação histológica, e quantificação de citocinas, por meio de citometria de fluxo. Os resultados mostraram que foi possível otimizar o cultivo de hOSEC de modo a manter a viabilidade inalterada durante os sete primeiros dias de cultivo. Ademais, demonstrou-se a presença de células imunes nas amostras de hOSEC coletadas e cultivadas. Após a otimização da infecção, foi possível demonstrar a presença de L. braziliensis, sua conversão progressiva de formas promastigotas para amastigotas e a diminuição progressiva da carga parasitária ao longo dos dias de cultivo. Por fim, foi possível demonstrar que os modelos hOSEC produzem níveis detectáveis de IL-10, IL-4, TNF-a, IFN-g, IL-6 e IL-2 ao longo dos dias de cultivo. No sétimo dia de infecção, houve modulação da produção de IL-2, com menor síntese de produção da citocina nas amostras infectadas. Tomados juntos, os resultados sugerem a imunocompetência dos modelos hOSEC e seu grande potencial para o estudo dos estágios iniciais da infecção por L. braziliensis.