Diversidade de vírus e agentes subvirais de DNA em plantas daninhas em cultivos do tomateiro e novos relatos em regiões neotropicais

Abstract

Os vírus constituem importantes agentes etiológicos de doenças emergentes em diversas culturas agrícolas, incluindo o tomateiro (Solanum lycopersicum). As plantas daninhas, por sua vez, exercem papel fundamental como reservatórios e hospedeiros alternativos, contribuindo para a persistência, diversidade e dispersão de vírus, especialmente aqueles que possuem genoma de DNA de fita simples (ssDNA), como os vírus dos gêneros Begomovirus, Citlodavirus, Mulcrilevirus, Badnavirus, Caulimovirus, Gemycircularvirus e Gemykolovirus. Informações sobre taxonomia características biológicas, etiologia de doenças, organização genômica, bem como transmissão e importância destes vírus e ferramentas de estudo são contempladas no Capítulo 1 desta tese. Com a crescente diversidade de espécies, o uso de ferramentas como o Sequenciamento de Alto Rendimento (High-Throughput Sequencing - HTS) tem possibilitado o estudo detalhado da diversidade viral e tem sido amplamente utilizado de forma consistente. O desenvolvimento e a evolução de novas tecnologias de HTS estão revolucionando a descoberta de vírus, o diagnóstico, os estudos metagenômicos e evolutivos. Dessa forma, o objetivo geral deste trabalho é compreender o papel das plantas daninhas associadas ao cultivo do tomateiro como reservatório de vírus de ssDNA, bem como alterações genéticas das populações. Com essa finalidade, foi realizado um levantamento da diversidade genética das populações virais, incluindo begomovírus que ocorrem em plantas daninhas e outras espécies de plantas associadas ao cultivo do tomateiro, pertencentes a 15 famílias botânicas: Asteraceae, Bignoniaceae, Brassicaceae, Cactaceae, Capparaceae, Caricaceae, Cleomaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Malvaceae, Moraceae, Poaceae, Ruscaceae e Solanaceae. Para isso, foram coletadas 114 amostras foliares com sintomas típicos de begomovírus. O DNA total das amostras foi extraído e utilizado como molde para RCA (Rolling Circle Amplification). O conjunto de amostras a partir de RCA foi preparado na forma de um pool de amostras que foi enviado para sequenciamento usando a plataforma NovaSeq6000 na Agrega. Após o sequenciamento, os dados foram analisados utilizando ferramentas de bioinformática. Como resultado proveniente do HTS foram recuperados 19.575.404 reads e 62.444 contigs. Foi possível recuperar 103 sequências virais sendo um total de 99 genomas completos e quatro genomas parciais. As sequências se distribuíram em cinco famílias distintas: Geminiviridae (85 contigs), Caulimoviridade (13 contigs), Genomoviridae (3 contigs), Alphasatellitidae (1 contig) e Circoviridade (1 contig). A família Geminiviridae foi a mais representativa, com três gêneros Begomovirus (83 contigs), Citlodavirus (1 contig), e Mulcrilevirus (1 contig). No gênero Begomovirus (família Geminiviridae) foi possível recuperar sete espécies conhecidas e cinco potenciais novas espécies denominadas: espécie nova #1 (C493), espécie nova #2 (C218), espécie nova #3 (C64), espécie nova #4 (C08) e espécie nova #5 (C329). Além disso, outra espécie nova denominada espécie nova #6 (C1998) (gênero Citlodavirus, família Geminiviridae) foi recuperada nesse pool. Análises para confirmação da hospedeira foram realizadas usando os primers ITS2F e ITS2R (Capítulo 2). Primers espécie-específicos foram empregados para recuperação dos genomas por PCR em cada amostra individualmente. Os resultados obtidos são apresentados e discutidos. A descrição e análise de 06 espécies novas encontra-se organizada por capítulo. Desta forma, informações sobre uma nova espécie, de genoma monopartido, classificada no Begomovirus foi denominada aqui de New species #5 C329 e detectada na amostra PR-134 coletada em 2012 em Capitão Leonidas Marques, Paraná, sul do Brasil. A análise filogenética mostrou que a nova espécie compartilha 84–85% de identidade com outros begomovírus, sendo a identidade filogeneticamente mais próxima de 85% com tomato severe rugose virus – ToSRV [MW596573] (Capítulo 3). No Capítulo 4, quatro novas espécies de begomovírus bipartidos recuperadas em HTS, tiveram a organização genômica analisada em detalhe quanto às ORFs e motivo, e foi encontrado o DNA-B correspondente a cada uma delas. A sequência parcial foi sequenciada via Sanger. O DNA-A foi recuperado via PCR com primers espécies-específicos. Isolados das espécies novas #1 (NS#1) e #2 (NS#2) foram detectados em amostras provenientes de Goiás - GO (RGO-835 e RGO-834). Dois isolados da espécie nova #3 (NS#3) foram detectados em amostras do Pará (PR-126 e PR-136). Sete isolados da espécie nova #4 (NS#4) foram identificados em amostras provenientes de três estados brasileiros: Goiás (RGO-836, RGO-838, RGO-834 e RGO-833), Distrito Federal (RDF-826 e RDF-827) e Rio Grande do Sul (RS-082). A análise filogenética demonstrou que NS#1 tem identidade filogenética mais próxima com BGMV (MN822294); NS#2 é filogeneticamente mais próxima de Cleome leaf crumple virus (CleLCrV) (FN4359999); NS#3 é mais próxima de tomato leaf distortion virus (ToLDV) (NC_038474), e NS#4 é mais próxima de Sidastrum golden leaf spot virus – SidGLSV (NC_038462). As análises de recombinação demonstraram existe evidência de recombinação entre as novas espécies NS#3 e NS#4. No Capítulo 5 informações sobre o gênero Mulcrilevirus detectado em uma amostra coletada no Distrito Federal (RDF-831) ilustram a importância de estudos HTS para conhecer a diversidade viral no país. Trata-se do primeiro registro desse vírus fora da China. A sequência C93 apresentou 92–93% de identidade (95% de cobertura da consulta) com isolados de Mulcrilevirus mori (= mulberry crinkle leaf virus – MCLV), dentre eles o isolado MN240483.1. No Capítulo 6, informações da descrição de uma nova espécie do gênero Citlodavirus são apresentadas. Isolado deste gênero foi detectado em uma amostra do Mato Grosso (MT-012), coletada em 2010 em Cuiabá, na região Centro-Oeste brasileira. A análise filogenética mostrou que a espécie compartilha 72,50% de identidade com Citlodavirus passiflorae (Passion fruit chlorotic mottle virus) [NC_040706.1]. No Capítulo 7 é relatada a identificação de CleLCrV em uma amostra coletada no Paraguai (PAR-005), em Mayor Otaño, no ano de 2010. Trata-se do primeiro registro desse vírus no Paraguai. Esse isolado apresentou de 94,33% de identidade (100% de cobertura) com o isolado de DNA-A de acesso FN435999.1. O Capítulo 8 apresenta o primeiro relato de um vírus do gênero Gemycircularvirus em repolho e malva, coletadas em 2022, uma na região do Distrito Federal (DF-824) e outra no estado do Goiás (RGO-834). Esse é o primeiro registro nessas hospedeiras. O isolado apresentou 91.26% de identidade com Gemycircularvirus mocha1 (Momordica charantia associated Gemycircularvirus; NC_075310.1). No capítulo 9 relata-se a detecção de um vírus do gênero Gemykolovirus em uma amostra coletada em Urutaí, estado de Goiás, em 2022 (RGO-833). O isolado apresentou 88.44% de identidade (56% de cobertura) com um isolado do vírus Gemykolovirus heris1 (Plant associated genomovirus 7 – PaGmV 7) [NC_076273.1]. Trata-se do primeiro relato de PaGmV 7 em Digitaria catamarcensis (Poaceae). No Capítulo 10 realizou-se uma conclusão geral e levantamento das perspectivas deste trabalho. Esses resultados reforçam a importância do monitoramento contínuo de plantas daninhas e não cultivadas que crescem nas proximidades das culturas, uma vez que podem atuar como reservatórios de vírus que contribuem para sua disseminação.