Produção em larga escala da lacase 1 recombinante de Cryptococcus neoformans no sistema de expressão heteróloga Pichia pastoris

Abstract

A meningoencefalite causada pelo fungo Cryptococcus neoformans em pacientes imunocomprometidos, principalmente em pacientes com HIV, tem causado aproximadamente 122 mil mortes por ano. Os mecanismos de infecção e sua virulência são objeto de intensa investigação. A melanização do fungo é um dos fatores que aumenta sua virulência, e é catalisada por uma enzima chamada lacase 1 (Lac1). Além da atividade descrita, constatou-se que essa enzima pode ser um dos fatores que permite a sobrevivência do fungo no próprio líquido cefalorraquidiano (LCR), contribuindo para sua permanência no encéfalo. A levedura, Pichia pastoris, é um bom modelo para produção de proteínas, a cepa X-33 dessa levedura foi transformada por um plasmídeo contendo a sequência codante de Lac1, com o objetivo de produção de lacase recombinante. A expressão da enzima nos transformantes foi testada por ABTS, otimizada por testes de produção temporal e foi visto que, em frasco, diferentes tempos de indução não causam diferença significativas na produção da proteína. Além disso, entendeu-se que a Lac1 possui sensibilidade a alterações de pH, com atividade entre as faixas de 5,1 - 6,1 e que o aumento de escala para 1,5 litros de cultura leva a uma necessidade de aumento da frequência do fluxo de alimentação com o indutor metanol.