Produção de quimosina bovina em Komagataella phaffii a partir de sistemas de expressão constitutivo

Abstract

K. phaffii (Pichia pastoris) é considerada uma das plataformas de expressão mais importantes no contexto da biotecnologia industrial devido à sua capacidade de produzirproteínas recombinantes solúveis e em níveis elevados quando comparada a outros sistemas eucarióticos. Os altos níveis de expressão são normalmente atingidos utilizando se o promotor induzível PAOX1, dependente de metanol, um composto tóxico e inflamável. A quimosina bovina é uma protease de interesse comercial na indústria alimentícia sendo utilizada na coagulação do leite para fabricação de queijos. Comercialmente, esta enzima é produzida por expressão heteróloga na levedura Kluyveromyces lactis e no fungo filamentoso Aspergillus niger. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma alternativa nacional para a produção industrial de quimosina bovina utilizando a em K. phaffii e com a controle da produção baseado nos promotores constituvos PPGK, PGAP e PTEF, eliminandoa necessidade da adição de metanol. O gene da pró-quimosina B foi clonado em vetores contendo um dos 3 diferentes promotores constitutivos descritos acimas, o fator de secreção alfa e o gene de resistência a kanamicina, kanR. Clones de levedura transformantes e secretores de quimosina foram selecionados pela formação de halos de hidrólise em placas contendo meio mínimo YNB e leite. A produção de quimosina pelo promotor PPGK foi confirmada em gel de poliacrilamida pela presença de uma banda de 40 kDa, identificada como a pró-quimosina que, após ativação em pH ácido, foi processada em sua forma madura (36 kDa). Para os clones contendo os promotores PGAPe PTEF, a temperatura de cultivo precisou ser otimizada para a produção da enzima. As atividades de coagulação observadas em todos os clones testados superaram aquelesobservados em trabalhos anteriores envolvendo o uso dos promotores PAOX1 e PGAP. Um maior número de cópias do gene de interesse não resultou em maiores atividades de coagulação. A quimosina secretada pela K. phaffii foi purificada em uma única etapa de cromatografia de exclusão molecular, o que resultou na obtenção de 670 mg/L de quimosina. A enzima recombinante apresentou as mesmas características das quimosinas comerciais no que se refere à especificidade ao substrato e termoestabilidade, mostrando-se, assim, como uma alternativa promissora para sua produção industrial.