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Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.unb.br/handle/10482/41537
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Title: Microrganismos geneticamente modificados aplicados à biocatálise
Authors: Manfrão Netto, João Heitor Colombelli
Orientador(es):: Parachin, Nádia Skorupa
Assunto:: Biocatálise
Ogataea polymorpha
Ácido hialurônico
Pseudomonas putida
Aminas aromáticas
Issue Date: 30-Jul-2021
Citation: MANFRÃO NETTO, João Heitor Colombelli. Microrganismos geneticamente modificados aplicados à biocatálise. 2021. 85 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2021.
Abstract: Biocatálise refere-se à utilização de enzimas ou células inteiras de microrganismos como catalisadores em uma reação química representando uma rota sustentável para síntese de químicos, principalmente devido à possibilidade de se utilizar resíduos industriais como substrato, por exemplo, a biomassa lignocelulósica. Com os avanços no campo da biotecnologia, várias moléculas podem ser sintetizadas através de biocatálise, incluindo compostos não produzidos naturalmente por microrganismos. Nestes casos, ferramentas de engenharia genética são utilizadas para inserção de genes exógenos ou para deleção de vias endógenas que competem pelo substrato, otimizando o processo de produção. Além disso, novas técnicas para edição de genes estão constantemente sendo desenvolvidas, ampliando os limites da biocatálise. Neste trabalho, o conceito de biocatalisador foi aplicado em dois microrganismos para o desenvolvimento de rotas alternativas para síntese de ácido hialurônico (AH) e vanililamina (VA). AH é um biopolímero de alto valor, presente na composição de diversos produtos médicos e cosméticos. Abordagens alternativas para sua síntese estão sendo desenvolvidas para substituir o atual método utilizando processos fermentativos com espécies produtoras naturais de AH do gênero Streptococcus. Neste trabalho, AH foi produzido a partir linhagens geneticamente modificadas da levedura Ogataea (Hansenula) polymorpha. Para isso, o gene hasA (hasAp de Pasteurella multocida e hasAs de S. zooepidemicus), o qual codifica a enzima hyaluronan synthase (HAS), bem como o gene hasB (de Xenopus laevis), codificador da enzima UDP-glucose dehydrogenase, necessários para a síntese heteróloga de AH foram inseridos no genoma desta levedura. Além disso, foi implementado um interruptor genético para a regulação de hasA e hasB por uma serina integrase (integrase-13, Int13). Ao todo foram desenvolvidas três linhagens produtoras de AH, com a maior produção (≅ 200 mg/L) obtida pela linhagem EMB103 contendo o interruptor genético. Esse valor é inferior aos obtidos por outros produtores heterólogos de AH, incluindo leveduras. Contudo, o potencial de O. polymorpha para produção de AH através da expressão de diferentes genes hasA bem como a utilização de um interruptor genético nessa levedura foram demonstrados de forma inédita. A segunda parte deste trabalho foi relacionada à produção de VA a partir de substratos derivados da lignina (vanilina e ácido ferúlico) utilizando a bactéria Pseudomonas putida como biocatalisador, demonstrando uma nova rota biotecnológica para síntese de aminas aromáticas. 8 A produção de VA por uma linhagem geneticamente modificada de P. putida (GN442ΔPP_2426) foi realizada através da superexpressão do gene CV-ATA que codifica para uma amina transaminase (ATA) de Chromobacterium violaceum bem como três ATAs endógenas de P. putida KT2440 identificadas através de análises in silico. Além disso, os genes codificadores das três ATAs endógenas e o gene CV-ATA foram superexpressos em P. putida KT2440 resultando em linhagens capazes de utilizar VA, que não é prontamente metabolizada como única fonte de carbono por esta bactéria. A maior produção de VA (0.915 mM) a partir de vanilina (10 mM) foi obtida pela linhagem TMB-JH004 superexpressando CV-ATA. Contudo, o processo foi limitado principalmente pela reassimilação do produto VA e pela formação de dois coprodutos, o ácido vanílico e o álcool vanilil. A expressão do gene AlaDH, o qual codifica uma alanina desidrogenase de Bacillus subtilis, levou a uma redução da reassimilação de VA representando uma estratégia eficaz para melhorar a produção de VA a partir de vanilina. Portanto, esses resultados demonstram o potencial de P. putida como biocatalisador para produção de aminas aromáticas a partir de derivados da lignina.
Abstract: Biocatalysis refers to the utilization of enzymes or whole cells of microorganisms as catalysts in a chemical reaction representing a sustainable route for chemical synthesis, mainly due to the possibility of using industrial waste as substrate, such as the lignocellulosic biomass. With advances in the biotechnology field, a wide range of molecules can be synthesized through biocatalysis, including compounds not naturally produced by microorganisms. In these cases, genetic engineering tools are utilized to insert exogenous genes or to delete endogenous pathways that compete for the substrate, optimizing the production process. Also, new techniques for gene editing are constantly being developed, expanding the limits of biocatalysis. In this work, the biocatalyst concept was applied to two microorganisms for the development of alternative routes for the synthesis of hyaluronic acid (HA) and vanillylamine (VA). HA is a high-value biopolymer, present in the composition of several medical and cosmetics products. Alternative approaches to its synthesis are being developed to replace the current method utilizing fermentative processes with natural HA producing species of the genus Streptococcus. In this work, HA was produced from genetically modified strains of the yeast Ogataea (Hansenula) polymorpha. For this, the genes hasA (hasAp from Pasteurella multocida and hasAs from S. zooepidemicus), which encodes the enzyme hyaluronan synthase (HAS), as well as the hasB gene (from Xenopus laervis) encoding the UDP-glucose dehydrogenase enzyme, necessary for the heterologous synthesis of HA were inserted into the genome of this yeast. Additionally, a genetic switch was implemented for the regulation of hasA and hasB genes by a serine-integrase (integrase-13, Int13). Altogether, three strains producing HA were developed, with the highest production (≅ 200 mg/L) obtained by strain EMB103 containing the genetic switch. This value is lower than titers obtained by other heterologous HA producers, including yeasts. Nevertheless, the potential of O. polymorpha for HA production by the expression of different hasA genes and the utilization of a genetic switch in this yeast were demonstrated for the first time. The second part of this work was related to VA production from lignin-derived substrates (vanillin and ferulic acid) utilizing the bacterium Pseudomonas putida as a biocatalyst, demonstrating a new eco-friendly route for the synthesis of aromatic amines. The production of VA by a genetically modified P. putida strain (GN442ΔPP_2426) was performed through the overexpression of the CV-ATA gene encoding an amine transaminase (ATA) from 10 Chromobacterium violaceum as well as by three endogenous ATAs from P. putida KT2440 identified by in silico analysis. Furthermore, the genes encoding the three endogenous ATAs and the CV-ATA gene were overexpressed in P. putida KT2440 resulting in strains capable to utilize VA, which is not promptly metabolized as the sole carbon source by this bacterium. The highest VA production (0.915 mM) from vanillin (10 mM) was obtained by the strain TMB- JH004 overexpressing CV-ATA. However, the process was limited mainly by the re- assimilation of VA and by the formation of two co-products, vanilic acid and vanillyl alcohol. The expression of AlaDH gene encoding an alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis led to a reduction in VA reassimilation representing an effective strategy to improve VA production from vanillin. Therefore, these results demonstrate the potential of P. putida as a biocatalyst to produce aromatic amines from lignin-derived substrates.
Description: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Appears in Collections:CEL - Doutorado em Biologia Molecular (Teses)

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