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Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.unb.br/handle/10482/39528
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Title: Caracterização estrutural, funcional e análise de inibição do sistema tioredoxina redutase (Trr1) – tioredoxina (Trx1) do fungo patogênico humano Cryptococcus neoformans
Authors: Bravo Chaucanés, Claudia Patrícia
Orientador(es):: Felipe, Maria Sueli Soares
Coorientador(es):: Barbosa, João Alexandre Ribeiro Gonçalves
Assunto:: Cryptococcus neoformans
Moléculas inibitórias
Estrutura cristalográfica
Criptococose
Infecção - fungos
Issue Date: 9-Oct-2020
Citation: BRAVO CHAUCANÉS, Claudia Patrícia. Caracterização estrutural, funcional e análise de inibição do sistema tioredoxina redutase (Trr1) – tioredoxina (Trx1) do fungo patogênico humano Cryptococcus neoformans. 2018. 222 f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.
Abstract: A criptococose é uma infecção fúngica fatal que se constitui em um problema de saúde crescente principalmente em indivíduos imunocomprometidas. As altas taxas de letalidade associadas as infecções por fungos indicam as falhas existentes nas atuais terapias, bem como o arsenal limitado de drogas com potencial antifúngico, sendo que muitas apresentam efeitos colaterais ou tóxicos. Ainda, a complexidade do tratamento pode ser atribuída em sua maior parte ao surgimento de resistência, demonstrando uma necessidade urgente de uma nova geração de agentes antifúngicos efetivos. A identificação de genes conservados essenciais necessários para o crescimento de fungos patogênicos é uma estratégia para a busca de novos alvos. Por genômica comparativa foram identificados genes ortólogos ausentes no genoma humano e presentes em fungos patogênicos humanos, entre estes, a tioredoxina redutase (Trr1), que foi selecionada como um possível candidato para a busca de novas drogas antifúngicas. Trr1 faz parte de um complexo conhecido como sistema tioredoxina, que contêm a tioredoxina (Trx), tioredoxina redutase (Trr) e o NADPH. Esta flavoenzima está localizada no citoplasma das células fúngicas e desempenha um papel crítico na manutenção do estado redox de diferentes tipos celulares. Neste trabalho foram purificadas e cristalizadas as proteínas recombinantes Trr1 e Trx1 de C. neoformans e na ausência de estruturas tridimensionais resolvidas para proteínas que participam do sistema tioredoxina em fungos patogênicos, foi determinada a estrutura 3D por cristalografia de raios X destas duas proteínas. As estruturas CnTrx1 e CnTrr1 foram resolvidas a 1,8 e 2,25 Å de resolução, respectivamente. Os resultados mostraram que CnTrx1 é um monômero em solução, estruturalmente tem um dobramento típico contendo o motivo do sítio ativo Cys-Gly-Pro-Cys conservado. Pequenas diferenças estruturais relacionadas com o seu estado oxidado e com regiões conservadas ao redor do local catalítico foram observadas quando comparadas com tioredoxinas de outras espécies. O estudo mostrou apenas mudanças menores entre CnTrx1 e Trx de Malassezia sympodialis usada como modelo. Embora as Trx tenham sido isoladas e caracterizadas em muitos organismos, essa nova estrutura 3D fornece informações importantes para a compreensão estrutural e funcional de Trx em fungos patogênicos humanos. Em relação à CnTrr1, a enzima é dimérica em solução, a massa molecular da enzima purificada por cromatografia de filtração em gel, foi estimada em cerca de 75 kDa. Além disso, observou-se que a intensidade de fluorescência da proteína diminui com o aumento da concentração de NADPH, apesar de não ter ocorrido forte deslocamento do centro de massa. Em pHs mais ácidos a enzima apresentou uma maior mudança conformacional. Em adição, os resultados de dicroísmo circular mostraram que as condições alcalinas e neutras não promovem alterações consideráveis da estrutura secundária em comparação com pHs ácidos, e a estabilidade térmica da proteína em diferentes pHs, foi maior em pH 7,0. A análise estrutural de CnTrr1 mostrou que o monômero é composto por dois domínios que formam os sítios de ligação ao FAD e ao NADPH. A distância de 2,04 Å entre os dois resíduos de cisteína mostra que CnTrr1 encontra-se na forma oxidada (FO). Como relatado em outros estudos, foi observado que o dissulfeto do sítio ativo está enterrado entre os domínios e não é acessível para o substrato. A comparação de CnTrr1 com Trr de baixa massa molecular revelou que a enzima fúngica tem loops extra na região N- e C-terminal. Adicionalmente, a obtenção do modelo CnTrr1 na forma reduzida (FR), revelou a mudança conformacional do domínio de NADPH. O modelo na conformação FR após simulação de dinâmica molecular, foi usado para construir o modelo complexado Trr1-Trx1 de C. neoformans. Os resultados mostraram que CnTrx1 interage com os dois domínios na CnTrr1, e várias interações parecem ser responsáveis pelo reconhecimento proteína-substrato em fungos. Já o estudo da atividade antifúngica in vitro com moléculas identificadas pela varredura virtual, mostrou que 2 moléculas, nas concentrações de 16 e 64 μg/mL, foram capazes de inibir o crescimento in vitro do fungo C. neoformans. Além disso, após o tratamento com essas moléculas, as células de levedura apresentaram alterações morfológicas, devido provavelmente aos defeitos de divisão celular. Embora estas moléculas não apresentaram toxicidade in vitro, a administração destas não foi capaz de reduzir a carga fúngica em tecidos dos camundongos (pulmão e cérebro). Em paralelo, foram realizados os ensaios de caracterização e inibição enzimática. Os valores dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx foram 1,344 μM, e 0,003697 μM/s, respectivamente, enquanto que os ensaios de inibição da CnTrr1 confirmaram que as 2 moléculas foram capazes de inibir especificamente a proteína recombinante Trr1. Visando investigar a interação das moléculas na estrutura 3D de CnTrr1, as moléculas inibitórias foram submetidas aos ensaios de docking, modelagem e dinâmica molecular. Os resultados mostraram que os compostos têm afinidade de ligação pelo sítio do complexo enzima-substrato mas, também ocuparam o sítio dos cofatores. Finalmente, os estudos funcionais sobre o gene TRR1 em C. neoformans, substituindo o promotor endógeno deste gene, demostraram que este participa na regulação de alguns dos fenótipos de virulência, e está associado com a resistência a vários agentes causadores de estresse. Já o tratamento com as 2 moléculas mencionadas mostrou ligeiras diferenças na atividade inibitória da proteína Trr1. Os resultados anteriores de TRR1 evidenciam a essencialidade deste gene no crescimento fúngico in vitro, e confirmam a Trr1, como um alvo potencial para pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos contra o fungo patogênico C. neoformans.
Abstract: Cryptococcosis is a fatal fungal infection that is a growing health problem, especially in immunocompromised individuals. The high lethality rates associated with fungal infections indicate that there are shortcomings in current therapies, as well as the limited arsenal of antifungal drugs, many of which present collateral or toxic effects. Further, the complexity of the treatment can be mostly attributed to the emergence of resistance, demonstrating an urgent need for a new generation of effective antifungal agents. Identification of conserved essential genes required for the growth of pathogenic fungi is a strategy for finding new targets. Studies comparative genomics identified orthologous genes absent in the human genome and present in human pathogenic fungi, among these, thioredoxin reductase (Trr1) was selected as a possible candidate for the search for new antifungal drugs. Trr1 is part of a thioredoxin complex, which contains thioredoxin (Trx), thioredoxin reductase (Trr1), and NADPH. This flavoenzyme is found in fungal cytoplasm and plays a critical role in maintaining the redox state of different cell types. In this work, the Trr1 and Trx1 recombinant proteins of C. neoformans were purified and crystallized, in the absence of resolved three-dimensional structures for proteins participating in the thioredoxin system in pathogenic fungi, the 3D structure was determined by X-ray crystallography. The CnTrx1 and CnTrr1 structures were resolved at 1.8 and 2.25 Å resolution, respectively. The results showed that CnTrx1 is a monomer in solution, structurally it has a typical folding containing the conserved Cys-Gly-Pro-Cys active site motif. Small structural differences related to their oxidized state and conserved regions around the catalytic site were observed when compared with thioredoxins from other species. The study showed only minor changes between CnTrx1 and Malassezia sympodialis Trx used as a search model. Although Trx have been isolated and characterized in many organisms, this new 3D structure provides important information for the structural and functional understanding of Trx in human pathogenic fungi. Regarding CnTrr1, the enzyme is dimeric in solution, the molecular weight of the protein by gel filtration chromatography was estimated to be about 75 kDa. Also, it was observed that the fluorescence intensity of the protein decreases with increasing concentration of NADPH, however, there was no strong displacement of the center of mass. In the more acidic pHs the enzyme presented a greater conformational change. In addition, circular dichroism showed that alkaline and neutral conditions do not promote significant alterations in secondary structure when compared to acidic pH, and the thermal stability of the protein at different pHs was higher at pH 7.0. Structural analysis of CnTrr1 showed that the monomer is composed of two domains that form the FAD/NADPH binding sites. The distance of 2.04 Å between the two Cys residues shows that CnTrr1 is in the oxidized form (FO). As reported in other studies, it has been observed that the active site disulfide is buried between the domains and is not accessible to the substrate. Comparison of CnTrr1 with low molecular weight Trr revealed that the fungal enzyme have extra loops in the N- and C-terminal regions. Additionally, obtaining reduced-form model (FR) revealed the conformational change in the NADPH domain. The FR conformation model after molecular dynamics simulation was used to built a simulated model of Trr1-Trx1 complex of C. neoformans. The results showed that CnTrx1 package against both domains in CnTrr1, and several interactions appeared to be responsible for protein-substrate recognition in fungi. On the other hand, evaluation of the in vitro antifungal activity with small molecules identified by the virtual screening showed that 2 molecules, at concentrations of 16 and 64 μg/mL, were able to inhibit in vitro growth of C. neoformans. In addition, after treatment with these molecules, yeast cells showed morphological changes probably due to defects in cell replication. Although the molecules were not toxic in vitro, the administration of these molecules did not reduce tissue fungal burden in mice infected (lung and brain). In parallel, enzymatic characterization and inhibition tests were performed. The kinetic parameters Km and Vmáx were 1.344 μM, and 0.003697 μM/s, respectively, whereas the inhibition assays of CnTrr1 confirmed that the 2 molecules are capable of specifically inhibiting the recombinant Trr1 protein. Aiming to investigate the interaction of the molecules in the 3D structure of CnTrr1, inhibitory molecules were subjected to docking, modeling and molecular dynamics assays. The results showed that the compounds have binding affinity for the substrate complexation site, but also occupied the site of the cofactors. Finally, functional studies in C. neoformans by replacing the endogenous TRR1 promoter have demonstrated that it participates in the regulation of some virulence phenotypes and it is associated with susceptibility to various stresses. Already, the treatment with the mentioned 2 molecules showed slight differences in the inhibitory activity of the protein CnTrr1. Previous results of TRR1 evidenced the essentiality of this gene for the in vitro growth, and confirm Trr1 as a potential target for research and development of new drugs against the pathogenic fungus C. neoformans.
Description: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF).
Appears in Collections:FMD - Doutorado em Patologia Molecular (Teses)

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