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Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.unb.br/handle/10482/39203
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Title: O soro apresenta maior proporção da variante Janus quinase 2 V617F comparado com amostras pareadas de sangue total-edta : um modelo de quantificação para variantes somáticas utilizando qPCR e o método de quantificação relativa 2- ∆∆cq
Authors: Almeida, Ana Luisa Santa Cruz de
Orientador(es):: Barra, Gustavo Barcelos
Assunto:: Janus quinase 2 (JAK2)
Método 2-∆∆Cq
Real Time Quantitative (PCR)
Real alelo específico
Amplification Refractory Mutation System (ARMS)
Quantificação relativa
Neoplasias mieloproliferativas
V617F
Issue Date: 7-Jul-2020
Citation: ALMEIDA, Ana Luisa Santa Cruz de. O soro apresenta maior proporção da variante Janus quinase 2 V617F comparado com amostras pareadas de sangue total-edta: um modelo de quantificação para variantes somáticas utilizando qPCR e o método de quantificação relativa 2- ∆∆cq. 2020. 66 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2020.
Abstract: A detecção da variante JAK2 V617F faz parte dos critérios diagnósticos para as neoplasias mieloproliferativas crônicas e proporções elevadas de alelo mutante estão associadas a piores prognósticos. A mutação é geralmente detectada em DNA de amostras de sangue total-EDTA através do método de PCR em tempo real alelo específico (AS-qPCR) e quantificação absoluta. Entretanto, alguns equipamentos de extrações de DNA automatizados co-extraem inibidores de PCR quando partem de sangue total e a quantificação absoluta necessita de um esforço maior para gerar e manter as curvas padrão. A variante JAK2 V617F pode ser detectada em soro através de PCR digital (ddPCR), uma espécime que apresenta menos inibidores quando comparada ao sangue total e é mais amigável aos extratores de DNA automatizados. Entretanto, equipamentos de ddPCR não são amplamente disponíveis como os termocicladores de qPCR. Neste estudo, foi avaliado se a variante patogênica JAK2 V617F pode ser corretamente quantificada por AS-qPCR através do método de quantificação relativa 2-∆∆Cq em DNA de amostras de sangue total-EDTA e validar o teste utilizando protocolos padrão em diagnóstico molecular. Em seguida, o método proposto foi aplicado para avaliar se a mutação pode ser corretamente detectada/quantificada em DNA de amostras de soro. O método proposto mostrou-se altamente exato (bias de 1,91%) comparado ao kit comercial (método referência), altamente preciso (CV% total de 0,40%, 1,92%, 11,12% em amostras com 93%, 54% e 2,5% de alelos mutantes, respectivamente) e extremamente sensível (limite de detecção de 0,16%) com resposta linear variando de 1,16% a 99,98% de alelos variantes. As amostras de soro foram quantificadas utilizando do método proposto e apresentaram média de alelos variantes 4% maior comparadas a amostras pareadas de sangue total-EDTA, o que permitiria aumentos nas taxas de detecção dessa variante e maior robustez nas análises.
Abstract: Detection of JAK2 V617F mutation is a diagnostic criterion for chronic myeloproliferative neoplasms and high levels of mutant alleles are associated with worse outcomes. This mutation is usually tested on blood DNA by allele-specific qPCR (AS-qPCR) and measured using absolute quantification. However, some automated DNA extractions co-extracts PCR inhibitors from blood and absolute quantification needs increased effort to maintain standard curves. JAK2 V617F can also be detected in serum using droplet digital PCR (ddPCR), a specimen with less inhibitors and favorable to automated extractions, but ddPCR instruments are not wide available as qPCR thermocyclers. Here, we evaluate whether JAK2 V617F could be accurately quantified by AS-qPCR using the 2-∆∆Cq method on blood DNA and validate the assay using gold-standard molecular diagnostic protocols. Next, we apply the validated method to assess if the mutation could be reliably detected/quantified in serum. JAK2 V617F could be quantified by AS-qPCR using 2-∆∆Cq method, the assay was highly accurate (bias of 1.91%) compared to a gold-standard commercial kit, highly precise (total CV% of 0.40%, 1.92%, 11.12% for samples with 93%, 54% and 2.5% of mutant allele), highly sensitive (limit of detection of 0.16%) and demonstrated a linear detection response from 1.16% to 99.98%. Serum showed a higher mean mutant allele burden of 4% compared to the paired whole blood samples what would allow for increased JAK2 mutant detection rates and favors increased JAK2 V617F high-throughput analysis.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2020.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Appears in Collections:FS - Mestrado em Ciências da Saúde (Dissertações)

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