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Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.unb.br/handle/10482/38164
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Title: O uso de baculovírus como ferramenta para produção de antígenos vacinais e kits diagnósticos de doenças humanas : raiva, febre amarela, dengue e zika
Authors: Baggio, Mayarha Patricia Dequigiovanni
Orientador(es):: Ribeiro, Bergmann Morais
Assunto:: Baculovírus
EDIII
Febre amarela
Poliedrina
GP64
GPV
NS1
Zika
Dengue
Raiva
Issue Date: 25-Jun-2020
Citation: BAGGIO, Mayarha Patricia Dequigiovanni. O uso de baculovírus como ferramenta para produção de antígenos vacinais e kits diagnósticos de doenças humanas: raiva, febre amarela, dengue e zika. 2019. 182 f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.
Abstract: O sistema de expressão em células de insetos utilizando baculovírus (BEVS) tem sido amplamente utilizado para uma variedade de aplicações, incluindo o uso como biopesticidas modificados, produção de proteína recombinante, expressão transitória de transgenes, e expressão de antígenos para uso vacinal ou em diagnóstico. Além da vantagem da produção de proteína heteróloga em grande escala com modificação pós-traducional eucariótica apropriada, as proteínas heterológas também podem ser exibidas no envelope viral. Esta tecnologia de apresentação na superfície preserva a estrutura multimérica nativa da proteína, expandindo assim a utilidade clínica e farmacêutica do sistema de baculovírus. No capítulo I, deste trabalho, foi avaliado o potencial imunogênico de BVs (“Budded virus”) recombinantes contendo um peptídeo imunogênico derivado da GPV (Glicoproteína) do vírus da raiva fusionado à proteína GP64 do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV). A GPV interage com os receptores celulares e contém os epítopos reconhecidos pelos anticorpos neutralizantes, sendo assim alvo para a produção de uma vacina de subunidade. Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da expressão da proteína recombinante (GP64Ag + GPV) por Western blot e imunomarcação na microscopia confocal. No capítulo II, o sistema BEVS foi utilizado para expressar o EDIII (domínio III), da proteína de envelope do vírus da febre amarela, fusionado à proteína poliedrina de Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Foi mostrado neste trabalho, a confirmação da correta expressão da proteína recombinante (Poliedrina + EDIII) por Western blot, microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura. As partículas virais recombinantes foram purificadas e inoculadas em camundongos. As análises imunológicas mostraram uma resposta imune específica a Th1/Th17 frente ao antígeno em camundongos após a imunização. Também foi observado que a proteína pode atuar como adjuvante durante a imunização e que desencadeia uma resposta imunológica específica. Assim este resultado sugere um possível uso deste recombinante como imunógeno. No capítulo III, foi avaliado a expressão de proteínas NS1 (proteína não-estrutural 1) recombinantes dos flavivírus Zika (ZIKV) e dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4) em células de inseto e seu uso como insumos para diagnóstico através da detecção do anticorpo anti-NS1 de DENV, no plasma de pacientes infectados. A proteína NS1 é secretada e circula no plasma no início da fase febril da doença, e pacientes produzem anticorpos específicos ao NS1 de flavívirus, além de anticorpos contra proteínas estruturais. Desta forma, peptídeos imunogênicos de NS1 de DENV 1, - 2, - 3 e 4 e ZIKV foram fusionados com a proteína poliedrina de AcMNPV e suas proteínas expressas foram purificadas com Tween 20 5% e confirmadas por Western blot, microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura. Para avaliar o efeito do antígeno frente ao soro de pacientes infectados com dengue, foi utilizado o método Elisa indireto que revelou sensibilidade alta dos antígenos. Testes complementares serão necessários para sua validação, mas acredita-se que esta estratégia pode proporcionar uma melhora na diagnose e na evolução do quadro dos pacientes acometidos.
Abstract: The baculovirus expression vector system (BEVS) has long been deployed for a variety of applications including for use as biopesticides, for recombinant protein production, transient transgene expression, tissue therapy, and for vaccine production. Apart from the advantage of large-scale heterologous protein production with appropriate eukaryotic posttranslational modification, foreign proteins can also be displayed on the viral envelope. This surface-display technology preserves the native multimeric structure of the protein, thereby expanding the clinical and pharmaceutical utility of the baculovirus system. In Chapter I of this work, the immunogenic potential of recombinant BVs (Budded virus) containing na immunogenic peptide derived from the GPV (Rabies Glycoprotein) fused with the GP64 protein of the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) was evaluated. GPV interacts with cell receptors and contains epitopes recognized by the neutralizing antibodies, being the target for the production of a subunit vaccine. It was shown in this work, the confirmation of the expression of the recombinant protein (GP64Ag + GPV) by Western blot and imune localization by confocal microscopy. In Chapter II, the expression baculovirus system was used to express the EDIII (domain III of the yellow fever envelope protein) fused to the polyhedrin protein of Autographa californica gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV). Confirmed expression of the recombinant protein (Polyhedrin + EDIII) by Western blot, light microscopy and scanning electron microscopy was shown. The immunological analyses showed a specific Th1/Th17 immune response against the antigen in mice after immunization. We also analyzed that the polyhedrin protein can act as an adjuvant during the immunization and can triggers an specific immune response. This result suggests a possible use of this antigen as an immunogen. In Chapter III, the expression of recombinant NS1 (non-structural protein 1) proteins of the zika (ZIKV) and dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4) in insect cells and evaluatad their use as diagnostic inputs through the detection of the anti- NS1 DENV antibody in the plasma of infected patients. NS1 protein is secreted and circulates in the plasma in the early stage of the disease, and patients produce specific antibodies to flavivirus proteins, as well as antibodies against structural proteins. In this way, NS1 immunogenic peptides from DENV 1, - 2, - 3 and 4 and ZIKV were fused to the polyether protein of AcMNPV and their expressed proteins were purified with 5% Tween 20 and confirmed by Western blotting, light microscopy and electron microscopy of scanning. To evaluate the antigen effect against the serum of patients infected with dengue the indirect ELISA method was used, which revealed high antigen sensitivity. Complementary tests will be necessary for its validation, but it is believed that this strategy can provide an improvement in the diagnosis and the evolution of the patient's condition.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
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