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Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.unb.br/handle/10482/38127
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Title: Desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais humanos ANTI-CD3
Authors: Castro, Nestor Fabian Leyton
Orientador(es):: Maranhão, Andréa Queiroz
Coorientador(es):: Brígido, Marcelo de Macedo
Assunto:: Anticorpos monoclonais humanos
ANTI-CD3
Anticorpos
Issue Date: 24-Jun-2020
Citation: CASTRO, Nestor Fabian Leyton. Desenvolvimento de novos anticorpos monoclonais humanos ANTI-CD3. 2019. 109 f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.
Abstract: O complexo CD3 está envolvido na ativação de células T durante a resposta imune, o que o torna um alvo importante para terapia imunossupressora. O anticorpo monoclonal (mAb) murino anti-CD3, OKT3, foi o primeiro mAb aprovado para uso clínico na terapia de rejeição de transplantes. Esse anticorpo foi descontinuado no início do século devido às suas características heterólogas que comprometiam a sua eficácia, já que promovia uma liberação de citocinas e ainda pelo fato de estimular o desenvolvimento de anticorpos neutralizantes, numa resposta conhecida como HAMA (Human Anti-Mouse Antibodies). Portanto, o desenvolvimento de novos mAbs anti-CD3 humano, com imunogenicidade e toxicidade reduzidas é importante para utilização em transplantes de órgãos e no tratamento de doenças autoimunes. O grupo de Imunologia Molecular da UnB realizou a humanização do anticorpo OKT3. Os domínios humanizados apresentaram capacidade de reconhecimento do antígeno CD3 e foram capazes de induzirem um perfil imunorregulatório em linfócitos T tratados, apesar de mostrarem uma aparente perda de afinidade, quando comparado ao anticorpo parental. Nesse sentido, esse trabalho teve como objetivo a obtenção de novos domínios VL humanos capazes de, em conjunto com o VH humanizado, reconhecerem o antígeno hCD3. As sequências de VLs (domínios variáveis da cadeia leve) foram amplificadas por PCR a partir de uma biblioteca de genes de anticorpos humanos. Os VLs foram clonados no fagomídeo pCIg 316, vetor que permite a fusão dos scFvs à proteína III do fago M13, e sua posterior apresentação na superfície de fagos filamentosos (Phage Display). Os fagomídeos contendo um domínio de VH previamente humanizado e a biblioteca de VL no formato de scFvs, foram utilizados para transformar células eletrocompetentes de Escherichia coli, linhagem XL1-Blue. Na transformação obteve-se um total de 1x107 clones, foram escolhidos 20 clones aleatórios e a sua variabilidade foi confirmada por sequenciamento e alinhamento. As células transformadas foram utilizadas para a produção de fagos de fusão. Fagos apresentando os diferentes scFvs foram produzidos de acordo com protocolos já estabelecidos. Cinco ciclos de seleção foram realizados, utilizando-se como ligante um peptídeo sintético que contém os domínios extracelulares γε da molécula do CD3 (CD3γε) humano associados por um peptídeo conector. Os ciclos foram realizados aumentando-se sucessivamente as lavagens para eliminação dos fagos não ligados. Após a seleção, foi obtido um enriquecimento na ordem de 315 vezes. Os domínios de VLs selecionados foram amplificados por PCR e sequenciados por Next xviii Generation Sequencing (NGS). Após a análise por bioinformática, utilizando um pipeline desenvolvido pelo grupo, duas sequencias foram escolhidas para melhor caracterização. Assim, dois scFvs contendo o VH humanizado e os dois domínios de VL humanos selecionados foram construídos e clonados no vetor de expressão pET28a. Células de E. coli, da linhagem SHuffle foram utilizadas para a expressão das proteínas recombinantes. As proteínas recombinantes foram obtidas a partir da fração solúvel de extratos citoplasmáticos de células induzidas. A purificação foi feita por cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). A capacidade de reconhecimento ao antígeno CD3γε humano foi confirmada por ELISA de ligação direta. Os resultados mostraram que as proteínas selecionadas durante o Phage display ligavam ao antígeno numa proporção maior que o controle murino (VH-VL do OKT3). Como perspectiva deste trabalho esses novos anticorpos anti-CD3 devem ser melhor caracterizados em ensaios de competição com o OKT3 e também quanto à indução de reposta imunorregulatória.
Abstract: The CD3 complex is involved in T cell activation during the immune response, which makes it an important target for immunosuppressive therapy. The murine anti-CD3 monoclonal antibody (mAb), OKT3, was the first mAb approved for clinical use in transplant rejection therapy. This antibody was discontinued at the beginning of the century, because of its heterologous characteristics that compromised its effectiveness as it promoted cytokine release and stimulated the development of neutralizing antibodies in a response known as HAMA (Human Anti-Mouse Antibodies). Therefore, the development of novel anti-human CD3 mAbs with reduced immunogenicity and toxicity is important for use in organ transplants and the treatment of autoimmune diseases. The UnB Molecular Immunology group carry out the humanization of the OKT3 antibody. The humanized domains showed CD3 antigen recognition capability and were able to induce an immunoregulatory profile in treated T lymphocytes, despite showing an apparent loss of affinity when compared to the parental antibody. Thus, this study aimed to obtain new human VL domains capable, together with humanized VH, to recognize the hCD3 antigen. VL sequences (light chain variable domain) were amplified by PCR from a human antibody gene library. The VLs were cloned into pCIg 316 phagemid, a vector that allows fusion of scFvs to phage M13 protein III, and their subsequent display on the surface of filamentous phages (Phage Display). Phagemids containing a previously humanized VH domain and the VL library in a scFv-shaped were used to transform Escherichia coli XL1-Blue electrocompetent cells. In the transformation a total of 1x107 clones were obtained, 20 random clones were picked and their variability was confirmed by sequencing and alignment. Transformed cells were used for fusion phage production. Phages displaying the different scFvs were produced according to established protocols. Five rounds of selection were performed using a synthetic peptide containing the γε extracellular domains of the human CD3 molecule (CD3γε) associated with a connector peptide. The cycles were performed by successively increasing the washes to remove unbound phage. After selection, an enrichment of 315 fold was obtained. The selected VL domains were PCR amplified and sequenced by Next Generation Sequencing (NGS). After bioinformatics analysis, using a pipeline developed by the group, two sequences were chosen for better characterization. Thus, two scFvs containing the humanized VH and the two selected human VL domains were constructed and cloned into the pET28a xx expression vector. E. coli cells of SHuffle strain were used for expression of recombinant proteins. Recombinant proteins were obtained from the soluble fraction of cytoplasmic extracts of induced cells. Purification was by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). The ability to recognize human CD3γε antigen was confirmed by direct binding ELISA. The results showed that the proteins selected during the Phage display bound the antigen to a greater extent than the murine control (OKT3 VH-VL). As a perspective of this study, these new anti-CD3 antibodies should be better characterized in competition tests with OKT3 and also in the induction of immunoregulatory response.
Description: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2019.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: CAPES
Appears in Collections:FMD - Doutorado em Patologia Molecular (Teses)

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