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Please use this identifier to cite or link to this item: https://repositorio.unb.br/handle/10482/35968
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Title: Efeito do uso combinado de inibidor de histona desacetilase e terapia fotodinâmica sobre o crescimento de Cryptococcus spp. in vitro
Authors: Morais, José Athayde Vasconcelos
Orientador(es):: Muehlmann, Luis Alexandre
Coorientador(es):: Fonseca, Márcio José Poças
Assunto:: Cryptococcus neoformans
Fungos patogênicos
Terapia fotodinâmica
Histona desacetilase
Inibidores
Issue Date: 12-Dec-2019
Citation: MORAIS, José Athayde Vasconcelos. Efeito do uso combinado de inibidor de histona desacetilase e terapia fotodinâmica sobre o crescimento de Cryptococcus spp. in vitro. 2019. 80 f., il. Dissertação (Mestrado em Nanociência e Nanobiotecnologia)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.
Abstract: Cryptococcus neoformans é um fungo patogênico oportunista encontrado mundialmente e é capaz de causar infecções potencialmente fatais, especialmente em pessoas com imunodeficiência. Limitações para o tratamento da infecção por C. neoformans envolvem a seleção de isolados resitentes aos antifúngicos convencionais, o tempo prolongado de tratamento e efeitos colaterais como nefrotoxicidade. Abordagens alternativas como a terapia fotodinâmica (TFD) e a intervenção epigenética poderiam contornar esses problemas. A TFD combina um agente fotossensibilizante (FS) não tóxico com luz vermelha e oxigênio molecular. A nanoemulsão de cloreto de ftalocianina de alumínio (NE-AlFtCl), desenvolvida por nosso grupo de pesquisa, demonstrou atividade inibitória sobre várias linhagens de células de câncer humano. Inibidores de histona desacetilase (HDACis), como o butirato de sódio (NaBut) e a tricostatina A (TSA), são frequentemente utilizados em tratamentos combinados com fármacos antineoplásicos visando a ação sinérgica e a redução de efeitos colaterais. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito da TFD mediada por NE-AlFtCl, combinada a NaBut ou a TSA, sobre o crescimento de C. neoformans linhagens H99 e T1 (resistente a fluconazol) e de C. gattii NIH198. As leveduras foram cultivadas na presença de NaBut ou TSA, expostas a diferentes concentrações de NE-AlFtCl, lavadas e semeadas em placas de 96 poços para aplicação de luz no comprimento de onda de 660 nm. A incorporação do agente fotossensibilizante foi avaliada após lise celular com dimetilsulfóxido (DMSO), detecção da fluorescência no lisado por espectrofluorímetro e por microscopia confocal. A proliferação celular em resposta a diferentes tratamentos foi avaliada pela densidade óptica a 600 nm. O efeito da TFD sobre a viabilidade celular foi avaliado por meio do teste colorimétrico de brometo de 3(4,5 dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e por diluição em série, seguida de semeadura em YPD sólido. O tempo de 30 min de incubação demonstrou-se suficiente para a incorporação máxima de NE-AlFtCl pelas leveduras. A microscopia confocal revelou que, em C. neoformans H99 e C. gattii NIH198, o AlFtCl se apresentou difuso pelo citoplasma. A linhagem T1 de C. neoformans apresentou menor incorporação do FS, que se concentrou na periferia celular. A TFD levou a redução da proliferação celular e essa redução foi acentuada pelo pré-tratamento das leveduras com NaBut ou TSA. A TFD demonstrou ainda citotoxicidade, dependente da concentração de FS, sobre as leveduras tratadas. O ensaio de diluição seriada demonstrou que o pré-tratamento com HDACi intensificou o efeito citotóxico da TDF. A linhagem T1 de C. neoformans demonstrou-se a mais resistente à ação de TFD em combinação com HDACi, enquanto C. gattii NIH 198 se mostrou mais sensível. Os resultados apresentados indicam a eficácia da TFD mediada por NE-AlFtCl, em combinação com o tratamento com HDACi, sobre o controle da proliferação de C. neoformans e C. gattii in vitro, podendo vir a representar uma proposta terapêutica alternativa para o tratamento de infecções fúngicas.
Abstract: Cryptococcus neoformans is an opportunistic pathogenic fungus found worldwide and is capable of causing life-threatening infections, especially in people with immunodeficiency. Limitations for the treatment of C. neoformans infection involve selection of isolates resistant to conventional antifungals, prolonged treatment time and side effects such as nephrotoxicity. Alternative approaches such as photodynamic therapy (PDT) and epigenetic intervention could circumvent these problems. PDT combines a non-toxic photosensitizing agent (PS) with red light and molecular oxygen. Aluminum phthalocyanine chloride (NE-AlPcCl) nanoemulsion, developed by our research group, demonstrated inhibitory activity on various human cancer cell lines. Histone deacetylase inhibitors (HDACis), such as sodium butyrate (NaBut) and trichostatin A (TSA), are often used in combination treatments with antineoplastic drugs for synergistic action and reduction of side effects. The aim of the present study was to evaluate the effect of NE-AlPcCl-mediated PDT, combined with NaBut or TSA, on the growth of C. neoformans strain H99 and T1 (fluconazole resistant) and C. gattii NIH198. Yeasts were cultured in the presence of NaBut or TSA, exposed to different concentrations of NE-AlPcCl, washed and seeded in 96-well plates for application of light at 660 nm wavelength. The incorporation of the photosensitizing agent was evaluated after cell lysis with dimethylsulfoxide (DMSO), detection of fluorescence in the lysate by spectrofluorimeter and by confocal microscopy. Cell proliferation in response to different treatments was evaluated by optical density at 600 nm. The effect of PDT on cell viability was evaluated by the colorimetric test of 3 (4,5-dimethylthiazol-2yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and by serial dilution, followed by seeding in solid YPD. The time of 30 min of incubation was demonstrated sufficient for the maximum incorporation of NE-AlPcCl by the yeasts. Confocal microscopy revealed that, in C. neoformans H99 and C. gattii NIH198, AlPcCl diffuse through the cytoplasm. The T1 line of C. neoformans presented a lower incorporation of PS, which was concentrated in the cellular periphery. PDT to reduced cell proliferation and this reduction was accentuated by yeast pretreatment with NaBut or TSA. PDT also demonstrated PS-dependent cytotoxicity on treated yeasts. The serial dilution assay demonstrated that pretreatment with HDACi enhanced the cytotoxic effect of PDT. The T1 line of C. neoformans was shown to be more resistant to the action of PDT in combination with HDACi, whereas C. gattii NIH198 was more sensitive. The results presented indicate the efficacy of NE-AlPcCl-mediated PDT, in combination with HDACi treatment, on the control of C. neoformans and C. gattii proliferation in vitro, and may represent an alternative therapeutic proposal for the treatment of fungal infections.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Pós-Graduação em Nanociência e Nanobiotecnologia, 2019.
Licença:: A concessão da licença desta coleção refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCT) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF).
Appears in Collections:IB - Mestrado em Nanociência e Nanobiotecnologia

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