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Title: Síntese, caracterização, estabilidade e efeitos biológicos in vitro de nanopartícula magnética associada a Anfotericina B
Authors: Iocca, Diêgo Cesar
Orientador(es):: Garcia, Mônica Pereira
Assunto:: Nanopartículas
Nanobiotecnologia
Fluidos magnéticos
Issue Date: 23-Jul-2013
Citation: IOCCA, Diêgo Cesar. Síntese, caracterização, estabilidade e efeitos biológicos in vitro de nanopartícula magnética associada a Anfotericina B. 2013. xv, 109 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2013.
Abstract: A nanotecnologia proporcionou o aumento de pesquisas em sistemas de entrega de drogas. Entre eles, os fluidos magnéticos (FM) mostram várias vantagens, tais como biocompatibilidade e biodegradação. FM são constituídos por nanopartículas de óxido de ferro superparamagnéticas em suspensão num fluido carreador. Nanopartículas magnéticas (NPMs) de maguemita estão entre as mais utilizadas em aplicações médicas. Anfotericina B (AmB) é o agente antifúngico mais utilizado no tratamento de casos graves da Paracoccidioidomycosis (PCM), a qual é uma micose sistêmica nativa na América Latina, tendo como agente etiológico é o fungo termo- dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Infelizmente, a AmB causa graves efeitos adversos (principalmente nefrotoxicidade) após administração intravenosa, limitando assim seu uso clínico. A fim de reduzir os efeitos adversos da AmB, foram sintetizadas nanopartículas de maguemita estabilizadas com ácido láurico (BCL) e conjugadas com anfotericina B (BCL-AmB). O presente estudo mostra a caracterização, estabilidade e ensaios biológicos de BCL-AmB. A atividade antifúngica de BCL-AmB foi determinada pela Concentração Inibitória Mínima - MIC (do inglês -Minimum Inhibitory Concentracion) contra o P. brasiliensis. Citoxicidade, avaliada pelo ensaio MTT, e genotoxicidade, analisada pela fragmentação de DNA em citometro de fluxo e ensaio cometa, foram determinadas em fibroblastos murinos (NIH-3T3) e em células renais de porco (LLC-Pk1). Os ensaios de toxicidade foram realizados em dois tempos experimentais (24 e 48 horas). O diâmetro médio das nanopartículas de maguemita foi estimado por difração de raio-X e por microscopia eletrônica de transmissão, apresentando valores de 13 e 9 nm, respectivamente. Analises por espectroscopia na região do infravermelho mostraram a presença do ácido láurico associado à nanopartícula e confirmaram a presença da AmB. O diâmetro hidrodinâmico (DH) de BCL-AmB e BCL, após a síntese, foi de 62 e 55 nm e o potencial zeta foi de -28 e -42 mV, respectivamente. BCL apresentou alta estabilidade em 240 dias, entretanto o DH de BCL-AmB aumentou neste período. BCL-AmB apresentou atividade antifúngica, com MIC de 1,25 µg/mL, enquanto o MIC da AmB livre foi de 1,0 µg/mL. BCL-AmB apresentou baixa toxicidade em células de mamíferos. Para as células NIH-3T3, a citotoxicidade de BCL-AmB foi menor que a citoxicidade da AmB livre em 24 horas, com CC50 de 20 e 6 µg/mL, respectivamente; enquanto que para as células LLC-Pk1, os valores da CC50 foram de 267 e 37 µg/mL, respectivamente. Similarmente, após 48 horas, a citotoxicidade de BCL-AmB ainda foi menor que a citoxicidade da AmB livre. Nas duas linhagens celulares utilizadas, a CC50 de BCL-AmB induziu menor fragmentação de DNA que a CC50 da AmB livre pelo ensaio cometa. Entretanto, pela citometria não ocorreram diferenças significativas entre todos os grupos. Portanto, os resultados observados sugerem que BCL-AmB poderá ser uma nova nanoferramenta no tratamento da PCM, uma vez que a AmB quando conjugada as nanopartículas manteve sua propriedade fungicida e apresentou baixos efeitos citotóxicos e genotóxicos. A nanoformulação BCL-AmB mostrou resultados promissores (in vitro), entretanto outros testes ainda serão necessários para verificar a eficiência do fármaco adsorvido e sua toxicidade in vivo. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Nanotechnology has dramatically increased the research on drug delivery systems. Among them, magnetic fluids (MF) have shown several advantages such as its biocompatibility and biodegradability. MF samples, consists of superparamagnetic iron oxide nanoparticles suspended in a carrier fluid. Maghemite is the most used magnetic nanoparticles (MNPs) in biological and medical applications. Amphotericin B (AmB) is still the polyene antifungal agent choice for the treatment of severe Paracoccidioidomycosis (PCM), which is a systemic mycosis native from Latin America. Its etiological agent is the dimorphic human pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Unfortunately, AmB causes acute side effects (mainly urinary problems) following intravenous administration, which limits its clinical use. In order to reduce the side effects of AmB, maghemite-based magnetic fluid stabilized with bilayer of lauric acid (BCL) and conjugated with AmB (BCL-AmB) were developed. The present study reports on characterization, stability and biological assays of BCL-AmB. Antifungal activity of BCL-AmB was determined by MIC (Minimum Inhibitory Concentration) assay against P. brasiliensis. Citotoxicity, evaluated by MTT assay, and genotoxicity, analysed by DNA fragmentation in flow cytometer and comet assays, were determined against murine fibroblast (NIH-3T3) and pig kidney (LLC-Pk1) cells line. Toxicity assays was evaluated at two different times (24 and 48 hours). The maghemite nanoparticles average size was estimated by X-ray diffraction and transmission electron microscopy showing value of 13 and 9 nm, respectively. Infra Red analysis showed the presence of lauric acid associated to the nanoparticles and confirmed the presence of Amphotericin B. Hydrodynamic diameters (HD) of BCL-AmB and BCL after synthesis was 62 and 55 nm and zeta potential was -28 and -42 mV, respectively. BCL has high stability on 240 days, however the HD of BCL-AmB increased at the same period. BCL-AmB presented antifungal activity, with MIC of 1.25 µg/mL, whereas the free AmB showed MIC of 1.0 µg/mL. BCL-AmB showed not toxicity for mammalian cells. For NIH-3T3 cells, the citotoxicity of BCL-AmB was lower than free AmB after 24h, with CC50 values of 20 and 6 µg/mL, respectively; whereas for LLC-Pk1 cells, the values were 267 and 37 µg/mL, respectively. Similarly, after 48h, the citotoxicity of BCL-AmB was still lower than free AmB. In both cells line, CC50 of BCL-AmB induced less DNA fragmentation than the CC50 of AmB by comet assay. However, by flow citometer assay, there is no difference between all groups. Hence, the results observed suggest that BCL-AmB may be a new nanotool of treatment for PCM, once the AmB in this nanoformulation is still antifungical and showed lower citotoxicity and genotoxicity effects. There are promising results in this model (in vitro) but tests are still needed to verify their in vivo mechanisms of toxicity.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013.
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