http://repositorio.unb.br/handle/10482/45731 2026-09-17T09:55:42Z http://repositorio.unb.br/handle/10482/55926 Título: Desenvolvimento de teste molecular de triagem neonatal para quantificação de TREC e KREC Autor(es): Sena, Thaís Lima de Resumo: Durante a maturação linfocitária, a recombinação somática dos receptores de antígenos gera círculos de DNA extracromossômicos, conhecidos como TREC (círculos de excisão de células T) e KREC (círculos de excisão de células B). A quantificação desses marcadores permite avaliar a competência do sistema imunológico, sendo fundamental para o rastreamento de imunodeficiências primárias, como a síndrome de DiGeorge, a agamaglobulinemia ligada ao X e a imunodeficiência combinada grave (SCID). A SCID é uma doença genética rara caracterizada por comprometimento da funcionalidade dos linfócitos T, B e/ou células NK, tornando os recém-nascidos altamente suscetíveis a infecções persistentes e recorrentes. Se não diagnosticada precocemente, a SCID pode levar a óbito nos primeiros meses de vida ou causar sequelas severas caso o tratamento seja tardio. Este estudo validou um ensaio de qPCR multiplex para a triagem neonatal da SCID e outras imunodeficiências, baseado na quantificação dos TRECs e KRECs. Para a padronização, foram utilizados plasmídeos como calibradores, além de 181 amostras biológicas para validação analítica e clínica. A análise envolveu o comparativo com 2 laboratórios de apoio que já realizam o teste: laboratório de Apoio 1 com 57 amostras de recém-nascidos, laboratório apoio 2 com 40 amostras e 84 amostras foram utilizadas em comparação com o kit comercial NeoScreen SMA/TREC/KREC Real-Time Detection da empresa DNA Technology. O DNA foi extraído de discos de 3 mm de papel filtro utilizando o kit Generation DNA (QIAGEN). A reação de qPCR foi realizada no termociclador CFX96 (Bio-Rad) utilizando primers específicos para TREC e KREC (sintetizados pela IDT), além da amplificação do gene RNAseP como controle interno para normalização da quantidade de DNA. As condições otimizadas incluíram primers e sondas a 0,8 μM e 0,4 μM, respectivamente, com protocolo de amplificação: 50 °C/120 s, 95 °C/10 min, seguido de 45 ciclos de 95 °C/5 s, 55 °C/15 s e 65 °C/45 s. A validação do método demonstrou eficiência de amplificação superior a 98%, coeficiente de determinação (r² ≥ 0,99) e um limite de detecção (LOD) de 8 cópias por reação para o equivalente a 13 Cópias/uL de sangue. Foram feitos ensaios de precisão, repetibilidade e reprodutibilidade. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética sob o parecer CAAE: 80346424.8.0000.0257. A implementação deste teste de triagem neonatal pode viabilizar diagnósticos precoces e intervenções terapêuticas oportunas, contribuindo para um prognóstico mais favorável em pacientes com SCID e outras imunodeficiências primárias. Informações adicionais: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2026. 2026-09-16T00:00:00Z http://repositorio.unb.br/handle/10482/55924 Título: Estratégia molecular para edição gênica do inibidor Bowman-Birk majoritário em sementes de soja Autor(es): Santos, Mateus Meira dos Resumo: A soja (Glycine max (L.) Merrill) é uma das principais fontes mundiais de proteína vegetal; contudo, seu aproveitamento nutricional é limitado pela presença de fatores antinutricionais, notadamente os Inibidores de Protease do tipo Bowman-Birk (BBI). Estas proteínas, altamente estáveis termicamente devido à sua estrutura rica em pontes dissulfeto, inibem a tripsina e a quimotripsina no trato digestivo de monogástricos, reduzindo a digestibilidade proteica e podendo causar hipertrofia pancreática. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de linhagens de soja da cultivar brasileira BRS 537 com teor reduzido de BBI, utilizando a tecnologia de edição genômica CRISPR/Cas9 para o knockout do gene Glyma.16G208900. A seleção deste gene como alvo prioritário baseou-se em análises in silico e validação experimental por RT-qPCR, que confirmaram sua expressão predominante durante o enchimento dos grãos. Análises estruturais via AlphaFold v2 e docking molecular atestaram a competência do modelo para a inibição bivalente (“cabeçadupla”). A estratégia de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens em eixos embrionários maduros resultou na regeneração de 220 plantas aclimatadas, com uma eficiência de transformação de 56,8%. Dentre os dois sgRNAs avaliados, apenas o sgRNA1 mostrou-se eficiente no direcionamento do complexo CRISPR/Cas9 ao gene alvo. Essa especificidade permitiu a identificação de 10 eventos de edição na geração T0 (Eventos 23, 32, 85, 88, 34, 21, 18, 84, 31 e 22), os quais exibiram uma diversidade de padrões mutacionais, incluindo deleções de −9 pb e −10 pb, além de inserções de +1 pb e +3 pb entre outros. Essas alterações geraram tanto mutações do tipo frameshift, que levam à formação de códons de parada prematuros, quanto deleções in-frame, capazes de desestabilizar domínios estruturais críticos, ambas viabilizando a perda funcional da proteína alvo. Esses resultados ratificam a eficiência e a viabilidade da edição gênica na cultivar BRS 537, estabelecendo uma base para o desenvolvimento de soja com qualidade nutricional superior. Informações adicionais: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2026. 2026-09-16T00:00:00Z http://repositorio.unb.br/handle/10482/55925 Título: Expressão de gene sintético em soja (Glycine max) visando maior tolerância a Sclerotinia sclerotiorum Autor(es): Anjos, Renan Miguel dos Resumo: A soja (Glycine max) uma commoditie de extrema relevância econômica para o Brasil, que é constantemente afetada por patógenos, principalmente os fúngicos, que comprometem de forma expressiva a produtividade e a qualidade dos grãos. Entre as doenças destaca-se a popularmente conhecida como mofo branco, causada pela Sclerotinia sclerotiorum, um patógeno hemibiotrófico, capaz de induzir a necrose tecidual causando perdas consideráveis no campo. Diante desse cenário, uma das estratégias utilizadas para contornar esse problema e gerar plantas mais produtivas e resistentes é por meio do uso de ferramentas biotecnológica como a transformação genética. Nesse trabalho, foi avaliado o efeito da expressão de uma construção quimérica, PG-PGIP, que une um fragmento de uma poligalacturonase fúngica de Fusarium phyllophilum (PG), fundido com um gene que codifica para uma proteína inibidora de poligalacturonase de Phaseolus vulgaris (PGIP), essa estratégia baseia-se na interação entre a PG fúngica e PGIP vegetal, que favorece a geração de oligogalacturonídeos (OGs), capazes de atuar como DAMPs (Damage-Associated Molecular Patterns) amplificando respostas de defesa e possivelmente tornando as plantas mais resistentes. Foram caracterizados dois eventos transgênicos diferentes, PG-PGIP 2.23 e PG-PGIP 1.45, quanto a inserção genômica do transgene, a progressão de lesão de S. sclerotiorum e o perfil de expressão de genes marcadores de vias hormonais de defesa, incluindo ácido salicílico (AS) e a ácido jasmônico (AJ). O evento PG-PGIP 2.23 apresentou uma redução significativa do desenvolvimento das lesões necróticos causadas pelo fungo, tanto nos bioensaio ex vivo quanto in vivo, tais resultados associados com as modulações observadas das vias do AS e AJ, sugerem um ajuste fino no balanço hormonal e resultante em plantas mais robustas imunologicamente. Em contrapartida, o evento PG-PGIP 1.45 apresentou um comportamento muito heterogêneo entre as progênies, com maior suscetibilidade nos bioensaios contra o fungo além de diferenças marcantes nos perfis de expressão genica das vias de defesa. Tais variações possivelmente estão associadas as inserções múltiplas no genoma, o processo de segregação que pode estar ocorrendo ou ainda a fatores epigenéticos e rearranjos ocorridos no processo de integração da construção no genoma, que influenciaram diretamente no estado fisiológico basal das plantas e na resposta de defesa das plantas. Esses resultados demonstraram que a estratégia PG-PGIP possui potencial para fortalecer a imunidade de plantas, mas que a eficácia é dependente da integração adequada do transgene no genoma para ocorra o desenvolvimento de eventos transgênicos com desempenho agronômico adequando e benéfico para o produtor e o meio ambiente. Informações adicionais: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2026. 2026-09-16T00:00:00Z http://repositorio.unb.br/handle/10482/55922 Título: Minimização da agregação proteica de fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFv) com aplicação em terapias de células CAR-T Autor(es): Franca, Luísa Valério Resumo: O mieloma múltiplo (MM) é um tipo de câncer hematológico caracterizado pela proliferação anormal de células plasmáticas, que apresentam superexpressão do antígeno de maturação de células B (BCMA). Apesar dos avanços nos tratamentos, o MM ainda é considerado incurável. A imunoterapia com células T geneticamente modificadas para expressar receptores quiméricos de antígeno (CAR-T) representa uma importante mudança de paradigma contra neoplasias hematológicas, incluindo MM. No entanto, a exaustão celular das células CAR-T, mesmo na ausência do alvo, é um fator limitante da eficácia desta abordagem. Um dos fatores que contribui para a exaustão das células CAR-T é a oligomerização dos fragmentos de anticorpos de cadeia única (scFvs) na porção extracelular dos CARs levando, consequentemente, à redução da sua atividade antitumoral. Portanto, este trabalho tem o objetivo de projetar novos fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) anti-BCMA, considerando a redução de sua imunogenicidade pela humanização e, adicionalmente do seu potencial de agregação, processo aqui denominado, em conjunto harmonização. Para tal, um scFv anti-BCMA murino disponível na literatura foi utilizado como base para o desenho de versões humanizadas e da versão harmonizada. O potencial de agregação teórico das sequências foi analisado in silico, resultando em três scFvs com graus crescentes de agregação prevista: humanizado, harmonizado e caótico. Os anticorpos foram expressos em formato solúvel em linhagens de Escherichia coli e purificados por métodos cromatográficos. Os resultados da detecção imunológica por western blotting confirmaram a expressão de anticorpos em bactérias transformadas após indução, com um acúmulo dependente do tempo. As análises de exclusão molecular e de espalhamento dinâmico da luz (DLS) corroboram os perfis de agregação previstos, pois o scFv harmonizado exibiu padrões de agregação inferiores em comparação às demais versões de scFvs. Além disso, análises com citometria de fluxo demonstraram que todos os scFvs são capazes de se ligar ao antígeno BCMA expresso em células de linhagem de MM. Com isso, os resultados preliminares possibilitam o aprimoramento da compreensão de agregação de anticorpos e sugerem que a harmonização pode ser aplicada para o desenho de novos CARs. Informações adicionais: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2026. 2026-09-16T00:00:00Z