UNIVERSIDADE DE BRAS?LIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERIN?RIA PROGRAMA DE P?S-GRADUA??O EM SA?DE ANIMAL C?LULAS-TRONCO MESENQUIMAIS PROVENIENTES DA MEDULA ?SSEA NA REPARA??O DE FALHAS ?SSEAS EXPERIMENTAIS NO OSSO IV METACARPIANO DE EQUINOS LU?S FERNANDO DE OLIVEIRA VARANDA DISSERTA??O DE MESTRADO EM SA?DE ANIMAL BRAS?LIA/DF FEVEREIRO/2012 UNIVERSIDADE DE BRAS?LIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERIN?RIA PROGRAMA DE P?S-GRADUA??O EM SA?DE ANIMAL C?LULAS-TRONCO MESENQUIMAIS PROVENIENTES DA MEDULA ?SSEA NA REPARA??O DE FALHAS ?SSEAS EXPERIMENTAIS NO OSSO IV METACARPIANO DE EQUINOS LU?S FERNANDO DE OLIVEIRA VARANDA ORIENTADORA: ROBERTA FERRO DE GODOY DISSERTA??O DE MESTRADO EM SA?DE ANIMAL PUBLICA??O: 053/2012 BRAS?LIA/DF FEVEREIRO/2012 REFER?NCIA BIBLIOGR?FICA E CATALOGA??O VARANDA, L.F.O. C?lulas-tronco mesenquimais provenientes de medula ?ssea na repara??o de falhas ?sseas experimentais do osso IV metacarpiano de equinos. Bras?lia: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterin?ria, Universidade de Bras?lia, 2012, 82 p. Disserta??o de Mestrado. Documento formal, autorizando reprodu??o desta disserta??o de mestrado para empr?stimo ou comercializa??o, exclusivamente para fins acad?micos, foi passado pelo autor ? Universidade de Bras?lia e acha-se arquivado na Secretaria do Programa. O autor reserva para si os outros direitos autorais de publica??o. Nenhuma parte desta disserta??o de mestrado pode ser reproduzida sem a autoriza??o por escrito do autor. Cita??es s?o estimuladas desde que citada a fonte. FICHA CATALOGR?FICA DEDICAT?RIA Varanda, Lu?s Fernando de Oliveira C?lulas-tronco mesenquimais provenientes de medula ?ssea na repara??o de falhas ?sseas experimentais do osso IV metacarpiano de equinos. / Lu?s Fernando de Oliveira Varanda/ Orienta??o de Roberta Ferro de Godoy ? Bras?lia, 2012. 82 p.: il. Disserta??o de Mestrado (M) ? Universidade de Bras?lia/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterin?ria, 2011. 1. Densidade ?ssea 2. Equinos 3. Medula ?ssea 4. Fra??o celular mononuclear. . I. Godoy, R; F.. II. T?tulo CDD ou CDU Agris / FAO ? minha fam?lia, meu alicerce para todas as intemp?ries enfrentadas ao longo da minha vida. AGRADECIMENTOS A Deus, pela minha exist?ncia e tamb?m pela minha sa?de que torna poss?vel alcan?ar os objetivos almejados. ? Universidade de Bras?lia, pela oportunidade de obter meu aperfei?oamento profissional, inicialmente pelo programa de resid?ncia m?dico veterin?ria e em seguida por meio do mestrado em sa?de animal. ? professora Roberta Ferro de Godoy, pela dedica??o na sua tarefa como orientadora. Apesar de n?o poder estar presente fisicamente em parte do projeto, n?o poupou esfor?os para a melhor orienta??o poss?vel. Obrigado pela paci?ncia com as minhas d?vidas e pelos ensinamentos ao longo desses anos. ?s colegas C?nthia Beatriz Drumond, J?lia Miranda e Juliana Sales, que foram grandes companheiras nessa jornada, e com as quais tive a oportunidade de dividir ?timos momentos durante a realiza??o desse experimento, tornando essa ?rdua tarefa poss?vel. Aos professores, residentes, estagi?rios e demais funcion?rios do HVET?O, pela disponibiliza??o da estrutura necess?ria, e pela ajuda na execu??o pr?tica do experimento, que foram imprescind?veis para a realiza??o do mesmo. ? minha namorada e m?dica veterin?ria Ana Lourdes Arrais de Alencar Mota, que esteve ao meu lado me dando todo apoio necess?rio. Al?m disso, contribuiu de forma decisiva durantes todas etapas desse processo. A minha fam?lia, que me deu suporte e incentivo para prosseguir com tranquilidade o processo de uma boa forma??o profissional, entendendo minhas aus?ncias nas datas importantes e encontros familiares. ? Secret?ria de Agricultura e Desenvolvimento Rural e em especial a m?dica veterin?ria Daniela Dianese pelo fornecimento dos animais utilizados nesse experimento. ? Professora Doutora Caroline Madeira Lucci e ao m?dico veterin?rio Jos? Luiz Jivago pela cess?o do Laborat?rio de Reprodu??o e Biotecnologia do Instituto de Biologia (CFS IB) para que fossem realizados os isolamentos das c?lulas mononucleadas de medula ?ssea. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnol?gico CNPq, pelo financiamento desse projeto. SUM?RIO P?G. LISTA DE TABELAS vii LISTA DE FIGURAS viii LISTA DE SIGLAS E ABREVIA??ES ix RESUMO xi ABSTRACT xii CAP?TULO I 1 INTRODU??O 1 REFERENCIAL TE?RICO 2 1.C?lulas-Tronco (CTs) 2 1.1.C?lulas-tronco Embrion?rias (CTE) 4 1.2.C?lulas-tronco Mesenquimais (CTMs) 6 2.CTMs no processo de Osteog?nese 9 3.Coleta e obten??o de c?lulas nucleadas de medula ?ssea 14 3.1.Medula ?ssea 14 3.2.Pun??o aspirativa de medula ?ssea 17 3.3.Separa??o da FCM da MO de equinos 20 4.Utiliza??o cl?nica e experimental da FCM de MO na repara??o ?ssea 21 REFER?NCIAS 25 CAP?TULO II - C?lulas-tronco mesenquimais provenientes da medula ?ssea na repara??o de falhas ?sseas experimentais no osso IV metacarpiano de equinos. I. coleta e isolamento 41 RESUMO 41 PALAVRAS-CHAVE 41 ABSTRACT 41 KEYWORDS 42 INTRODU??O 42 MATERIAIS E M?TODOS 44 RESULTADOS 47 DISCUSS?O 50 CONCLUS?ES 52 AGRADECIMENTOS 53 REFER?NCIAS 53 CAP?TULO III - C?lulas-tronco mesenquimais provenientes da medula ?ssea na repara??o de falhas ?sseas experimentais do osso IV metacarpiano de equinos. II. Avalia??o do efeito osteog?nico. 59 RESUMO 59 PALAVRAS-CHAVE 59 ABSTRACT 60 KEYWORDS 60 INTRODU??O 60 MATERIAIS E M?TODOS 63 RESULTADOS 71 DISCUSS?O 75 CONCLUS?ES 77 AGRADECIMENTOS 78 REFER?NCIAS 78 vii LISTA DE TABELAS P?G Tabela 1. Contagem de c?lulas da fra??o mononuclear (FCM) obtidas em 20 mL de medula ?ssea, quantidade de c?lulas-tronco mesenquimais presentes na FCM (valor calculado) e viabilidade de c?lulas da FCM. 49/71 Tabela 2. Graus de regenera??o ?ssea obtidos pela an?lise subjetiva do MT e MC nos diferentes tempos de avalia??o. Os valores dos graus foram obtidos utilizando a moda dos graus determinados por cinco avaliadores. 72 Tabela 3. Valores m?dios da densidade mineral ?ssea (DMO) em mil?metros de alum?nio (mm/Al) no membro tratado (MT) e membro controle (MC) nos diferentes tempos de an?lise radiogr?fica. 74 viii LISTA DE FIGURAS P?G. Figura 1. A - Regi?o contendo c?lulas mononucleadas obtidas ap?s centrifuga??o em Ficoll Hypaque. B - Pellet obtido ao final do processo de isolamento. 46 Figura 2. Agulha para pun??o de MO modelo Jamshidi, de calibre 8G e 12 cm de comprimento, introduzida na quinta estern?bra. 47 Figura 3. A - Aspira??o do conte?do de MO com seringa de 60 ml. B - Parte da primeira al?quota de MO aspirada, que foi expelida em placa de Petri para a verifica??o a olho nu da presen?a de esp?culas ?sseas e gl?bulos de gordura, sugerindo a origem medular da amostra. 49 Figura 4. Falha ?ssea de um cent?metro no osso IV MTC no momento da cirurgia 65 Figura 5. A- Agulha posicionada no local do enxerto percut?neo no momento da realiza??o da radiografia para confirma??o do correto posicionamento da agulha. B- Radiografia na proje??o dorsolateral- palmaromedial mostrando a correta localiza??o da agulha para enxerto percut?neo na falha ?ssea. 68 Figura 6. Demonstra??o da tela do programa Adobe Photoshop CS5, que mostra a densidade radiogr?fica da ?rea marcada pelo ret?ngulo (flecha vermelha) em n?veis de cinza, a m?dia, o desvio padr?o e a mediana, bem como o histograma. (A) Mensura??o da densidade mineral na regi?o do defeito ?sseo. (B) Mensura??o da densidade mineral na escala de 10 mmAl. 70 Figura 7. Imagens radiogr?ficas do MT e MC do animal 1 nos diferentes tempos de analise radiogr?fica. 73 Figura 8. Valores m?dios da densidade mineral ?ssea (DMO) em mil?metros de alum?nio (mm/Al) no Membro Tratado (MT) e Membro Controle (MC) nos diferentes tempos de an?lise radiogr?fica. 74 ix LISTA DE SIGLAS E ABREVIA??ES CEUA-UnB - Comit? de ?tica no Uso Animal da Universidade de Bras?lia CFS IB - Laborat?rio de Reprodu??o e Biotecnologia do Instituto de Biologia cm ? Cent?metro COBEA - Col?gio Brasileiro de Experimenta??o Animal CTs ? C?lulas-Tronco CTS ? C?lulas-Tronco Som?tica CTA ? C?lulas-Tronco Adulta CTE ? C?lulas-Tronco Embrion?ria CTMs ? C?lulas-Tronco Mesenquimais DMEN ? Meio Dubelcco Modificado por Eagle D ? Dia DMO ? Densidade Mineral ?ssea FAV ? Faculdade de Agronomia e Medicina Veterin?ria FCM ? Fra??o de C?lulas Mononucleadas FGF ? Fator de Crescimento Fibrobl?stico g ? For?a Gravitacional g/mL ?Gramas por Mililitro IGF-I - Fator do Crescimento do Tipo Insulina IM - Intramuscular IV - Intravenosa IV MTC ? Osso Quarto Metacarpiano kg - Quilograma LLP2A - Pepitideomim?tico Espec?fico de Alta Afinidade para Osso MC ? Membro Controle mcg/kg ? Micrograma por quilograma mg/kg ? Miligrama por quilograma mL - Mililitros mL/kg ? Mililitros por Kilograma MO ? Medula ?ssea MT ? Membro Tratado PTH- Horm?nio da Paratire?ide x PGE2 ? Prostaglandina E2 SEAGRI-DF ? Secret?ria de Agricultura e Desenvolvimento Rural do Distrito Federal SRD ? Sem Ra?a Definida TGF-? - Fator de Crescimento Transformador ? UnB ? Universidade de Bras?lia UI/mL ? Unidades Internacionais por Mililitro xi RESUMO A velocidade e qualidade do reparo ?sseo s?o alguns dos grandes obst?culos enfrentados por m?dicos veterin?rios na cl?nica cir?rgica de equinos. Dessa forma, terapias alternativas que possam auxiliar no processo de osteog?nese t?m sido utilizadas experimentalmente e clinicamente em diversas esp?cies animais e em humanos. O seguinte estudo teve como objetivo a avalia??o da t?cnica de coleta de medula ?ssea (MO) de equinos em esta??o, do isolamento de fra??o de c?lulas mononucleadas (FCM) de MO e do efeito osteog?nico do enxerto percut?neo aut?logo da FCM de MO por meio de an?lise subjetiva e pelos valores de densidade mineral ?ssea (DMO) em falhas ?sseas experimentais no osso IV Metacarpiano. Foram utilizados seis equinos de ambos os sexos. Ap?s cinco dias da realiza??o da falha ?ssea nos dois ossos IV metacarpianos, a MO foi aspirada do osso esterno de cada equino. Do material aspirado foi isolado a FCM por meio de centrifuga??o e separa??o em gradiente de concentra??o Ficoll Hypaque. Em seguida, foi realizado o enxerto percut?neo de FCM e DMEM no membro tor?cico direito (Membro Tratado MT) e apenas DMEM no membro tor?cico esquerdo (Membro Controle MC) de cada animal. A coleta de MO com os animais sedados em esta??o mostrou-se um m?todo de baixo custo e pass?vel de ser realizado rotineiramente. O m?todo de isolamento utilizado apresentou resultados semelhantes aos de outros estudos com equinos e em outras esp?cies. A m?dia de c?lulas nucleadas foi de 7,1 x 10? c?lulas/mL, a de c?lulas-tronco mesenquimais calculada foi de 710 c?lulas/mL e a viabilidade celular m?dia foi de 86,2%. Os valores da DMO foram estatisticamente superiores no MT em rela??o ao MC em seis dos onze tempos de an?lise radiogr?fica. O MT obteve grada??o subjetiva de preenchimento ?sseo superior ao MC em todos animais, sendo que em um animal essa diferen?a foi observada em quatro tempos de avalia??o (animal 5), em dois animais em cinco tempos (animais 1 e 3) e nos dois animais restantes em seis tempos (animais 2 e 4). Os resultados obtidos demonstram que a FCM de MO estimulou o processo de osteog?nese acelerando a repara??o ?ssea e aumentando a quantidade de matriz ?ssea mineralizada. PALAVRAS-CHAVE: Densidade ?ssea, Equinos, Medula ?ssea, Fra??o celular mononuclear. xii ABSTRACT The speed and quality of bone repair are major obstacles faced by veterinarians in equine clinical surgery. Thus, alternative therapies that can assist in the process of osteogenesis have been used experimentally and clinically in several animal species and humans. The aim of this study was to evaluate the collection of bone marrow (BM), the mononuclear cells fraction (MCF) isolation and to evaluate the osteogenic effect of percutaneous autologous MCF graft from BM by means of analysis and the subjective values of bone mineral density (BMD) in experimental bone defects in IV metacarpal bone. We used six horses that underwent surgery, where 1cm defects were created in both IV metacarpal bones. Five days after the surgery the BM was aspirated from the sternum of each horse. The MCF was isolated by centrifugation and separation on Ficoll Hypaque gradient of concentration. Then the graft was performed percutaneously. We injected MCF+DMEM on the right side (treated limb- TL) and only DMEM on the left (control limb-CL) of each animal. The bone marrow collection proved to be a inexpensive procedure and can be made routinely. The isolation method showed similar results to other studies in horses and other species. The average number of nucleated cells was 7.1 x 10 ? cells from 20 mL of BM, the mesenchymal stem cells number was calculated at 710 cells and the average cell viability was 86.2%. The BMD values were significantly higher in TL compared to the MC in six of the eleven times radiographic analysis. The obtained subjective grading bone fill in TL was better than in CL in all animals, and in an animal such difference was observed in four times of assessment (animal 5), five times in two animals (animals 1 and 3) and in two animals remaining six days (animals 2 and 4). The results show MCF stimulated osteogenesis process accelerated bone repair and increased the number of mineralized bone matrix. KEYWORDS: Bone density, Equine, Bone Marrow, Mononuclear cell fraction. CAP?TULO I 1 INTRODU??O As c?lulas-tronco (CTs), presentes em todos os vertebrados, s?o c?lulas indiferenciadas, capazes de auto-renova??o e diferencia??o em m?ltiplas linhagens de c?lulas e tecidos, respons?veis pela auto-repara??o tecidual. Durante o desenvolvimento do pr?-embri?o s?o encontradas c?lulas totipotentes e pluripotentes, chamadas de embrion?rias (CTE). Nos tecidos adultos, s?o encontradas c?lulas-tronco multipotentes, denominadas adultas (CTAs) ou som?ticas (CTS) (DEL CARLO et al., 2008). Dentre as CTS encontram-se as c?lulas-tronco mesenquimais (CTMs), com ampla plasticidade e capacidade de migra??o para locais de les?o tecidual e de promover a manuten??o e regenera??o de m?ltiplas linhagens de c?lulas do organismo (SOTIROPOULOU et al., 2006; NAUTA, FIBBE, 2007). As CTMs est?o presentes, em pequenas quantidades, em todos os tecidos adultos, incluindo a medula ?ssea (MO), tecido adiposo, peri?steo, tecido muscular e ?rg?os parenquimatosos. Essas c?lulas caracterizam-se pela habilidade de produzir qualquer tipo celular necess?rio num processo de repara??o, como osteoblastos, condroblastos, hepat?citos, c?lulas epiteliais, renais, card?acas, entre outros. Tal plasticidade possibilita perspectivas terap?uticas promissoras com esse grupo celular, tornando-o foco de pesquisas em todo o mundo (PITTENGER et al., 1999; ZAGO, COVAS, 2006). As CTMs s?o coletadas principalmente da MO, tecido adiposo e de ?rg?os parenquimatosos (CROVACE et al., 2008). A MO ? a forma tradicional pela qual se obt?m c?lulas de um doador para um transplante. O material obtido ? bastante heterog?neo e cont?m uma grande diversidade de c?lulas, incluindo c?lulas maduras do sangue, linf?citos, fragmentos do estroma, gordura, c?lulas-tronco hematopoi?ticas e uma pequena quantidade de CTMs (ZAGO, COVAS, 2006; CROVACE et al., 2008). A MO pode ser utilizada como fonte de CTMs diretamente ou pode ser processada. Dentre as formas de processamento, a centrifuga??o em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque para obten??o de FCM foi utilizada em alguns estudos obtendo uma quantidade e qualidade celular adequada. A FCM pode ser utilizada 2 diretamente na les?o ou pode-se realizar o isolamento e expans?o das CTMs, por meio de cultivo in vitro (ZAGO, COVAS, 2006; CROVACE et al., 2008). O uso da FCM para o tratamento de les?es ortop?dicas apresenta algumas vantagens em rela??o ? terapia com CTMs ap?s cultivo celular, como possibilidade de utiliza??o logo ap?s diagn?stico da les?o e menor custo e tempo de preparo (ALVES et al., 2009). O processo de isolamento de c?lulas nucleadas aumenta a concentra??o de CTMs para o implante direto quando comparado com o enxerto de MO integral (FORTIER, SMITH, 2008; ZAGO, COVAS, 2006). V?rios estudos t?m demonstrado que o enxerto percut?neo de MO integral ou de FCM de MO tem diminu?do o tempo de repara??o ?ssea (BARROS et al., 2001; DEL CARLO et al., 2007; DALLARI et al.,2007; ZAMPROGNO, 2007; ; CROVACE et al., 2008; YAMASAKY et al., 2008; OLIVEIRA et al. ,2010). A terapia com FCM de MO na repara??o ?ssea tem sido estudada em diversas esp?cies, por?m at? o momento n?o existem estudos que relatem sua utiliza??o em equinos. Dessa forma, o seguinte estudo teve como objetivo a avalia??o da t?cnica de coleta de medula ?ssea (MO) de equinos em esta??o, do processo de isolamento de fra??o de c?lulas mononucledas (FCM) da MO neta esp?cie e do efeito osteog?nico do enxerto de FCM de MO em falhas ?sseas experimentais por meio DMO e da classifica??o do preenchimento ?sseo em falhas ?sseas realizadas experimentalmente no osso IV MTC. REFERENCIAL TE?RICO 1. C?lulas-Tronco (CTs) As CTs s?o c?lulas indiferenciadas capazes de se diferenciar originando progenitores maduros, bem como c?lulas efetoras completamente diferenciadas (SCHWINDT et al., 2005). As CTs podem ser definidas segundo tr?s propriedades: I) auto-renova??o, ou seja, capacidade de originar outra CT com caracter?sticas id?nticas; II) habilidade de se diferenciar em mais de uma linhagem celular; e III) capacidade de originar c?lulas funcionais nos tecidos derivados da mesma linhagem (TAKAHASHI et al., 1998). Assim, apresentam uma s?rie de caracter?sticas que as 3 tornam candidatas ? utiliza??o terap?utica. Acredita-se que c?lulas-tronco presentes nos diferentes tecidos tenham papel regenerativo quando estes sofrem uma les?o. Entre os tecidos conhecidos por apresentarem c?lulas-tronco ap?s a vida p?s-natal, a medula ?ssea foi a mais estudada (BYDLOWSKI et al., 2009) Levando-se em considera??o algumas distin??es, como o n?vel de plasticidade que estas c?lulas possuem, quantas diferentes vias que podem seguir, e para qual por??o de um organismo funcional elas podem contribuir, as c?lulas- tronco classificam-se em totipotentes, pluripotentes e multipotentes (SOUZA et al., 2003).Conceitualmente, existem dois tipos gerais de c?lulas-tronco potencialmente ?teis para utiliza??o terap?utica: as c?lulas-tronco embrion?rias e as c?lulas-tronco adultas. O potencial de diferencia??o das primeiras est? bem caracterizado em camundongos e em humanos, no entanto seu uso em terapia celular e em pesquisa tem sido dificultado por quest?es de histocompatibilidade, seguran?a e ?tica. Em contraste, as c?lulas-tronco adultas n?o apresentam estes empecilhos, apesar da extens?o de sua plasticidade ainda estar sob investiga??o (PEREIRA, 2008). Durante o desenvolvimento do pr?-embri?o s?o encontradas c?lulas totipotentes e pluripotentes, chamadas de embrion?rias (CTE). Al?m do embri?o, as c?lulas-tronco tamb?m s?o encontradas em v?rios ?rg?os e tecidos no indiv?duo adulto, onde participam da homeostase tecidual, gerando novas c?lulas devido ? renova??o fisiol?gica ou em resposta a uma inj?ria. Tais popula??es celulares indiferenciadas mantidas no organismo adulto s?o denominadas c?lulas-tronco adultas CTAs ou c?lulas-tronco som?ticas CTS (BJORNSON et al., 1999; CLARKE et al., 2000). Existe um linhagem de CTAs multipotentes contidas na medula ?ssea, em s?tios espec?ficos de cada tecido adulto e at? no sangue perif?rico, s?o denominadas de c?lulas-tronco mesenquimais CTMs. (FAGOT-LARGEAULT, 2004). Dentre todas as linhagens de CTAs estudadas at? o presente momento, as CTMs apresentam maior plasticidade, originando tecidos mesodermais e n?o mesodermais (ZAGO, COVAS, 2004; MEIRELLES et al., 2006). As CTMs caracterizam-se por ser uma popula??o de c?lulas multipotentes capazes de se diferenciar e produzir quase todos tipos celulares necess?rios num processo de repara??o, como osteoblastos, condroblastos, hepat?citos, neur?nios, c?lulas epiteliais, renais, card?acas, dentre outras (PITTENGER et al., 1999). Tais 4 caracter?sticas de plasticidade sugerem que esse tipo celular ? o respons?vel pelo turnover e pela manuten??o de todos os tecidos do organismo (CAPLAN, 2009). 1.1. C?lulas-tronco Embrion?rias (CTE) As CTEs s?o c?lulas indiferenciadas, denominadas totipotentes, pois podem originar quaisquer tecidos animais. H? 28 anos foram isoladas a partir da massa celular interna de blastocistos murinos e cultivadas in vitro (EVANS, KAUFMAN, 1981; ALISON, 2009) A primeira etapa vis?vel da diferencia??o do embri?o se d? no momento que este atinge o est?gio de blastocisto, quando se observa duas popula??es distintas de c?lulas, aquelas que d?o origem aos tecidos extra-embrion?rios, como a placenta, e as c?lulas da chamada massa celular interna, que originam todos os tecidos do embri?o. Estas c?lulas podem ser removidas do embri?o, colocadas em placa de cultura e, em condi??es apropriadas, podem se manter indiferenciadas, multiplicando-se indefinidamente em laborat?rio com preserva??o do potencial de diferencia??o em todos os tipos celulares adultos (PEREIRA, 2008). As CTEs apresentam como caracter?stica principal a pluripot?ncia, ou seja, quando re- introduzidas em um embri?o possuem a capacidade de retomar o desenvolvimento normal, colonizando diferentes tecidos numa demonstra??o contundente de sua ampla plasticidade (EVANS, KAUFMAN, 1981). Entretanto, quando injetadas em animais imunodeficientes, as c?lulas-tronco embrion?rias tem a capacidade de responder aos diferentes est?mulos in vivo se diferenciando desordenadamente e levando a forma??o de tumores que apresentam diversos tipos de tecidos, os teratomas (PEREIRA, 2008). As c?lulas-tronco encontradas em embri?es humanos de at? sete dias s?o consideradas totipotentes e s?o capazes de formar um novo embri?o em sua totalidade; aquelas encontradas em embri?es com mais de 7 dias e no cord?o umbilical s?o pluripotentes, pois podem dar origem a v?rios tecidos, mas n?o a todos (PEREIRA, 2008). As primeiras divis?es celulares d?o origem de cinquenta a cem c?lulas aparentemente id?nticas. ? medida que o embri?o se desenvolve, suas c?lulas 5 iniciam um processo de diferencia??o, se comprometendo em dar origem a tipos espec?ficos de tecido do indiv?duo adulto. As CTs embrion?rias tamb?m podem ser induzidas a iniciar um programa de diferencia??o in vitro, simulando o desenvolvimento de um embri?o pr?-implantado (KELLER, 1995). Atrav?s de an?lises morfol?gicas, imuno-histoqu?micas e moleculares, uma grande variedade de linhagens embrion?rias pode ser identificada na massa celular diferenciada, incluindo hematopoi?tica, neuronal, endotelial, card?aca e muscular. As CTs embrion?rias s?o utilizadas como modelo in vitro de desenvolvimento embrion?rio precoce, o que as torna um poderoso instrumento de pesquisa para o estudo dos mecanismos de diferencia??o celular e dos efeitos de subst?ncias t?xicas e biologicamente ativas no desenvolvimento embrion?rio, entre outros (SCHOLZ et al., 1999). Para direcionar a diferencia??o das CTs embrion?rias no laborat?rio em tipos espec?ficos de c?lulas, uma s?rie de protocolos foram desenvolvidos. Dessa forma, por meio de estudo com camundongos foi poss?vel transform?-las em c?lulas nervosas, c?lulas produtoras de insulina, c?lulas do musculo card?aco e c?lulas da MO, entre outras. Atualmente, j? ? poss?vel que c?lulas derivadas das CTs embrion?rias transplantadas em animais doentes exer?am um efeito terap?utico em modelos de v?rias doen?as, incluindo doen?a de Parkinson, paralisia por trauma de medula espinhal, diabetes e leucemia, transformando-se em c?lulas nervosas, produtoras de insulina ou medula ?ssea, entre outras. Ou seja, a terapia celular com CTs embrion?rias j? est? comprovada em modelos animais com camundongos, e por isso a enorme expectativa da comunidade cient?fica em torn?-las uma realidade em seres humanos e demais esp?cies animais (PEREIRA, 2008). No entanto, existem grandes entraves ?ticos, pol?ticos e religiosos para ampla utiliza??o dessas c?lulas, j? que a obten??o de CTs embrion?rias envolve obrigatoriamente a destrui??o do embri?o, especificamente, de um blastocisto - um embri?o pr?-implanta??o de cinco dias. Certas culturas/religi?es atribuem ao embri?o humano desde o momento da fecunda??o o status de vida com todos os direitos de uma pessoa j? nascida - e por isso a destrui??o daquele embri?o torna-se inaceit?vel (PEREIRA, 2008). No Brasil, o uso do embri?o humano foi primeiramente regulamentado pela Lei de Biosseguran?a (Lei 11.105), de 24 de mar?o de 2005, que diz: 6 Art. 5? ? permitida, para fins de pesquisa e terapia, a utiliza??o de c?lulas-tronco embrion?rias obtidas de embri?es humanos produzidos por fertiliza??o in vitro e n?o utilizados no respectivo procedimento, atendidas as seguintes condi??es: I ? sejam embri?es invi?veis; ou II ? sejam embri?es congelados h? 3 (tr?s) anos ou mais, na data da publica??o desta Lei, ou que, j? congelados na data da publica??o desta Lei, depois de completarem 3 (tr?s) anos, contados a partir da data de congelamento. ? 1o Em qualquer caso, ? necess?rio o consentimento dos genitores. ? 2o Institui??es de pesquisa e servi?os de sa?de que realizem pesquisa ou terapia com c?lulas-tronco embrion?rias humanas dever?o submeter seus projetos ? aprecia??o e aprova??o dos respectivos comit?s de ?tica em pesquisa. O fato do Brasil possuir uma legisla??o espec?fica sobre pesquisa e utiliza??o terap?utica de CT, quando muitos pa?ses ainda n?o a possuem, coloca-o em posi??o de destaque na comunidade cient?fica internacional (BURGARDT, 2009). Al?m disso, garante a continuidade das pesquisas com CTE que estavam suspensas por infringir antigos preceitos ?ticos e reitera a imagem do pa?s como estado laico, no qual as decis?es pol?ticas n?o s?o pautadas em cren?as religiosas (PAESE, 2007). Pesquisas com finalidades terap?uticas, envolvendo CTE, devem ser realizadas de forma cautelosa e, enquanto n?o se desvendar toda a biologia destas in vivo, deve-se prosseguir com as pesquisas in vitro (DEL CARLO et al., 2009). 1.2. C?lulas-tronco Mesenquimais (CTMs) Inicialmente, acreditava-se que as CTS possu?am seu potencial de diferencia??o restrito somente ?s c?lulas do tecido no qual se encontravam. Por?m, nos ?ltimos anos, diversas pesquisas t?m demonstrado que algumas linhagens de 7 CTS s?o capazes de originar tecidos diferentes de sua forma??o embrion?ria (PEREIRA, 2008). As CTMs s?o consideradas uma linhagem de CTS e est?o presentes em regi?es perivasculares de todos os tecidos adultos, em pequenas quantidades, incluindo a medula ?ssea (MO), o tecido adiposo, o peri?steo, o tecido muscular e os ?rg?os parenquimatosos (MEIRELLES et al., 2008; MAMBELLI et al., 2009; ZUCCONI et al., 2009). A MO constitui um dos principais s?tios doadores dessas c?lulas, assim como de c?lulas-tronco hematopo?ticas e endoteliais (PITTENGER et al., 1999; MINGUELL et al., 2000). O termo CTM foi popularizado por Caplan (1991) em refer?ncia ao trabalho de Friedenstein e Owen (FRIEDENSTEIN et al., 1970). Caracterizam-se por ampla plasticidade, capacidade de migra??o para locais de les?o tecidual e de promover a manuten??o e regenera??o de m?ltiplas linhagens de c?lulas do organismo (SOTIROPOULOU et al., 2006; NAUTA; FIBBE, 2007). Dentre todas as CTAs estudadas at? o presente momento, as CTMs destacam-se por sua elevada plasticidade, podendo originar tecidos mesodermais e n?o mesodermais. Possuem tamb?m, caracter?sticas que ampliam as possibilidades de utiliza??o terap?utica (MONTEIRO et al., 2009). Al?m disso, as CTMs secretam uma grande variedade de citocinas pr? e antiinflamat?rias e fatores de crescimento e, por meio dessas mol?culas bioativas, proporcionam a modula??o da resposta inflamat?ria, o restabelecimento do suprimento vascular e a repara??o adequada do tecido, contribuindo para a homeostasia tissular e imunol?gica sob condi??es fisiol?gicas. Tamb?m podem induzir as demais c?lulas presentes no nicho tecidual a secretarem outros fatores sol?veis que estimulam a diferencia??o dessas c?lulas indiferenciadas, favorecendo o processo de repara??o. A terapia celular com CTMs ? uma alternativa terap?utica promissora, por?m a compreens?o da biologia dessas c?lulas ainda ? uma ci?ncia em forma??o (MONTEIRO et al., 2009). Inicialmente acreditava-se que as CTMs originavam linhagens celulares diferentes por transdiferencia??o. Segundo essa teoria, elas alterariam sua express?o g?nica para a de uma linhagem celular completamente diferente, originando tipos celulares distintos (HERZOG et al., 2003). A transdiferencia??o pode ocorrer de forma direta, quando a c?lula altera seu citoesqueleto e sua s?ntese 8 prot?ica para rediferenciar-se em outro tipo celular espec?fico, ou indireta, quando desdiferencia-se em uma c?lula-tronco mais primitiva para, posteriormente, se rediferenciar em outro tipo celular (VERFAILLIE, 2002; HERZOG et al., 2003). Outro mecanismo de diferencia??o celular proposto ? a fus?o. Acredita-se que as CTMs podem fundir-se a uma c?lula adulta-alvo, assumindo o padr?o de express?o g?nica da c?lula adulta a qual se uniu. A fus?o celular ? um fen?meno biol?gico amplamente conhecido, ocorrendo principalmente nas c?lulas cuja poliploidia (dois ou mais conjuntos de cromossomos) ? comumente vista, como em hepat?citos e c?lulas musculares esquel?ticas (HERZOG et al., 2003; MEIRELLES et al., 2006). Al?m disso, as CTMs secretam uma grande variedade de quimiocinas, e expressam receptores para citocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, as CTMs interagem com as c?lulas residentes (nicho) e podem induzi-las, por mecanismo par?crino, a se diferenciar em linhagens celulares distintas, de acordo com essa sinaliza??o (TAKAHASHI et al., 2007). As CTMs est?o presentes, em pequenas quantidades, em todos os tecidos adultos. Essas c?lulas caracterizam-se pela habilidade de produzir qualquer tipo celular necess?rio num processo de repara??o, como osteoblastos, condroblastos, hepat?citos, c?lulas epiteliais, renais, card?acas, entre outros. Tal plasticidade possibilita perspectivas terap?uticas promissoras com esse grupo celular, tornando-o foco de pesquisas em todo o mundo (PITTENGER, et al., 1999; ZAGO, COVAS 2006). As CTMs s?o coletadas, principalmente, da MO, tecido adiposo e de ?rg?os parenquimatosos (CROVACE., et al. 2008). A MO ? a forma tradicional pela qual se obt?m c?lulas de um doador para um transplante. O material obtido ? bastante heterog?neo e cont?m uma grande diversidade de c?lulas, incluindo c?lulas maduras do sangue, linf?citos, fragmentos do estroma, gordura, c?lulas-tronco hematopoi?ticas e uma pequena quantidade de CTMs (ZAGO, COVAS, 2006; CROVACE et al., 2008). As CTMs tem sido isoladas da MO de roedores (FRIEDENSTEIN et al., 1974; SIMMONS et al., 1991, BITTENCOURT et al., 2006), humanos (PITTENGER et al., 1999), gatos (MARTIN et al., 2002), c?es (HUSS, HOY, DEEG, 1995) e su?nos (RINGE et al., 2002). 9 Para as aplica??es terap?uticas, utiliza-se desde a fra??o celular mononuclear (FCM) da medula ?ssea, que cont?m pequenas quantidades de CTMs, at? culturas expandidas em laborat?rio, obtidas de diversos ?rg?os (MONTEIRO et al., 2008). Essas c?lulas podem ser transplantadas para os s?tios lesionais logo ap?s a ocorr?ncia da les?o tecidual e podem ser aplicadas na forma indiferenciada, recebendo o est?mulo do meio para posterior diferencia??o, ou sofrer diferencia??o em cultura antes da implanta??o (DEL CARLO et al., 2004; DEL CARLO et al., 2008). As CTMs s?o uma popula??o heterog?nea de c?lulas que proliferam, in vitro, como c?lulas aderentes ao pl?stico, tendo morfologia semelhante ao fibroblasto (DEL CARLO et al., 2009). As CTMs podem ser isoladas por v?rios m?todos, sendo o mais frequente a centrifuga??o em gradiente de densidade para obten??o da fra??o de c?lulas mononucleares. As c?lulas mononucleares isoladas s?o cultivadas com meio contendo soro fetal, sendo que as CTMs aderem ao pl?stico da garrafa de cultivo celular. Algumas c?lulas da linhagem hematopo?tica tamb?m podem aderir, mas, com o tempo, com as v?rias trocas do meio de cultura, s?o removidas. Portanto, enquanto este procedimento elimina a maior parte das c?lulas contaminantes, a heterogeneidade remanescente da cultura diminui progressivamente com as diversas passagens e, ap?s determinado n?mero delas, a cultura torna-se enriquecida pela fra??o que se autorrenova (BYDLOWSKI et al., 2009). As c?lulas-tronco de diferentes esp?cies, como humanos e equinos, j? podem ser isoladas e cultivadas in vitro (HEGEWALD et al., 2004). As c?lulas-tronco mesenquimais do estroma medular, tamb?m conhecidas como unidades formadoras de col?nias fibrobl?sticas (CFU-F) s?o c?lulas que aderem a placas de cultura e formam col?nias semelhantes a fibroblastos in vitro (BITTENCOURT et al., 2006). Esta caracter?stica tem despertado interesse em muitos veterin?rios, que consideram as c?lulas-tronco mesenquimais como agentes terap?uticos potenciais para problemas musculoesquel?ticos como tendinites, desmites, les?es ?sseas e articulares, t?o frequentemente encontradas em cavalos atletas (VIDAL et al., 2006). 2. CTMs no processo de Osteog?nese 10 A remodela??o ?ssea ? um processo em que ocorre degrada??o localizada de osso seguida por deposi??o em igual quantidade de osso nesse mesmo local. A reabsor??o do osso ? efetuada por c?lulas ?sseas denominadas osteoclastos e envolve a remo??o dos minerais e a degrada??o dos constituintes org?nicos da matriz ?ssea. A forma??o de osso ? realizada por c?lulas ?sseas denominadas osteoblastos e compreende a produ??o da matriz org?nica e a sua subsequente mineraliza??o (NORONHA, 2005) Este processo envolve a morte de c?lulas diferenciadas, como osteoblastos, e a sua substitui??o por osteoblastos rec?m-diferenciados. Os novos osteoblastos derivam de uma linhagem de c?lulas progenitoras multipotentes denominadas c?lulas-tronco mesenquimais CTMs, que s?o encontradas na medula ?ssea e em todos os tecidos em pequenas quantidades (CAPLAN, 2005). As c?lulas osteoprogenitoras prov?m das CTMs multipotentes, podendo encontrar-se no estroma medular, no peri?steo (superf?cie externa de todos os ossos) e no end?steo (superf?cie interna do osso compacto). As c?lulas osteoprogenitoras diferenciam-se posteriormente em pr?-osteoblastos, os percursores diretos dos osteoblastos (NIJWEIDE et al., 1996) A forma??o de osso, osteog?nese ou ossifica??o ? o mecanismo pelo qual os ossos se formam durante o desenvolvimento embrion?rio e pelo qual se inicia a forma??o de osso, por exemplo, na repara??o de uma fratura. Embora o processo de repara??o da fratura envolva respostas da medula ?ssea (MO), c?rtex, e partes moles adjacentes, Mckibbin (1978) chegou ? conclus?o de que a resposta mais importante ? a do peri?steo, onde c?lulas precursoras indiferenciadas contribuem para o processo de repara??o por meio de uma recapitula??o de ossifica??o intramembranosa embrion?ria e da forma??o ?ssea endoncondral. Na ossifica??o intramembranar ou direta, s?o formados os ossos chatos como a mand?bula e a calv?ria, e o segundo, ossifica??o endocondral ou indireta, atrav?s do qual s?o formados os ossos longos, as v?rtebras, os ossos p?lvicos e os ossos da base do cr?nio (GILBERT, 2000). O processo de ossifica??o intramembranar ocorre por diferencia??o direta das c?lulas mesenquimais em osteoblastos. Este processo inicia-se pela condensa??o do mes?nquima que se torna altamente vascularizado. Algumas CTMs diferenciam- se em osteoblastos, iniciando a forma??o de esp?culas de osso (trab?culas) com 11 organiza??o aleat?ria de col?geno (osso imaturo). A forma??o de osso compacto vai ocorrer por compacta??o das trab?culas (GILBERT, 2000). A ossifica??o endocondral ocorre nos ossos longos, curtos e irregulares, e envolve a forma??o de cartilagem a partir da agrega??o de CTMs, e a subsequente substitui??o do tecido cartilag?neo por osso: Este processo inicia com a indu??o por fatores par?crinos das c?lulas do mes?nquima a expressarem fatores de transcri??o, que atuam na ativa??o de genes espec?ficos da cartilagem. As CTMs condensam-se em n?dulos compactos e diferenciam-se em condr?citos (c?lulas da cartilagem). Os condr?citos proliferam rapidamente e formam um modelo de cartilagem e ao dividirem-se segregam uma matriz extracelular espec?fica da cartilagem. Numa fase seguinte, os condr?citos cessam a prolifera??o, aumentando significativamente o seu volume, tornando-se condr?citos hipertr?ficos. Estes v?o alterar a composi??o da matriz, o que vai permitir a sua mineraliza??o. Em seguida, ocorre a forma??o de uma camada fina de osso entre o peri?steo e o limite do modelo de cartilagem. Uma vez que, como consequ?ncia da mineraliza??o da matriz extracelular, deixa de haver difus?o de oxig?nio, de nutrientes e de produtos resultantes da degrada??o celular, os condr?citos morrer?o por apoptose deixando um esqueleto de cartilagem calcificada. Haver?, ent?o, uma invas?o pelo peri?steo de capilares sangu?neos, que penetram na cavidade medular da camada fina de osso. Desta forma, ? permitida a entrada de c?lulas osteoprogenitoras e de c?lulas hematopoi?ticas no modelo cartilag?neo e estas ?ltimas v?o formar medula ?ssea. Algumas c?lulas do peri?steo diferenciam-se em osteoblastos e iniciam a deposi??o de osso trabecular (GILBERT, 2000). Segundo Einhorn (1998), a consolida??o de uma fratura compreende um complexo mecanismo reparador que resulta na restaura??o quase completa da arquitetura ?ssea normal, ao contr?rio de outros tecidos, que cicatrizam com a forma??o de tecidos reparadores pouco organizados. A les?o tecidual ocasionada por traumas ou agentes qu?micos e/ou infecciosos pode resultar em perda anat?mica e funcional da integridade dos tecidos. Imediatamente, uma sequ?ncia complexa de eventos ? desencadeada na tentativa de restaurar a integridade da ?rea lesionada (MARTIN, 1997). A uni?o de osso secund?rio ocorre por uma complexa diferencia??o de CTMs em condroblastos, condr?citos, fibroblastos e osteoblastos, que ir?o formar o calo ?sseo 12 (YOO, JOHNSTONE, 1998). Ap?s a les?o tecidual, um co?gulo se forma logo nos primeiros minutos; as plaquetas tornam-se ativadas e liberam fatores de crescimento. Em sequ?ncia, desenvolve-se um processo inflamat?rio envolvendo as c?lulas do sistema imune (poucas horas ap?s a les?o), primeiramente neutr?filos, macr?fagos e c?lulas dendr?ticas (resposta imune inata) e, posteriormente, linf?citos (resposta imune adquirida) (MARTIN, 1997; TSIROGIANNI et al., 2006). Os macr?fagos, al?m de iniciarem a resposta inflamat?ria, fagocitam os debris celulares, e subst?ncias antig?nicas interagem com as c?lulas da resposta adaptativa e produzem mol?culas estimulat?rias e mediadores inflamat?rios, que, inicialmente, ativam mecanismos e c?lulas participantes do processo de repara??o (TSIROGIANNI et al., 2006). Paralelamente ? ocorr?ncia da resposta inflamat?ria, as c?lulas endoteliais s?o ativadas pela les?o vascular e hip?xia tecidual, e mais c?lulas do sistema imune s?o quimioatra?das. Essa quebra na homeostasia tecidual gera um est?mulo para a ativa??o das CTMs do peri?steo. Em resposta a essa ativa??o e ? perda de contato com as c?lulas endotelias e com a membrana basal, as CTMs do peri?steo proliferam-se, elevam o n?mero de mol?culas bioativas secretadas (fatores de crescimentos e mol?culas de ades?o, principalmente), migram para o local de les?o e/ou por diapedese entram na corrente circulat?ria onde exercer?o efeitos par?crinos (TSIROGIANNI et al., 2006; MEIRELLES et al., 2008). As CTMs tamb?m expressam uma grande variedade de receptores para quimiocinas e fatores de crescimento. Dessa forma, as CTMs podem ser estimuladas pelas c?lulas residentes (nicho) a se diferenciar ou secretar fatores sol?veis que estimular?o outros nichos celulares. Dessa forma, quanto mais agudo o processo patol?gico ou quanto mais vascularizada a regi?o afetada, mais intensa ? a sinaliza??o do nicho e mais efetiva ser? a resposta das CTMs (FUCHS et al., 2004; MORRISON et al., 2008). Em um ambiente favor?vel biologicamente e mecanicamente as CTMs proliferar?o e diferenciar?o em osteoblastos e condroblastos (CARTER et al., 1998). Essas c?lulas produzem matriz com forma??o de osteoide e cartilagem dando origem ao calo. A oste?ide mineralizada e a cartilagem sofrem processo de ossifica??o endocondral formando osso at? completo preenchimento da lacuna. Sendo assim, os eventos celulares s?o quimiotaxia, migra??o, prolifera??o e diferencia??o e as CTMs s?o as precursoras desse processo (KRAUS; KIRKER- HEAD 2006). 13 Quando expandida in vitro as CTMs podem ser induzidas a se diferenciar em diversos tecidos. Para diferencia??o osteog?nica ? utilizado o acido asc?rbico, que ? importante para a express?o de col?geno, o glicerofosfato como uma fonte de fosfato durante a mineraliza??o, e a dexametasona para regular o processo de diferencia??o celular. Tamb?m s?o utilizados o horm?nio da paratireoide D3, a prote?na ?ssea morfogen?tica (AICHER et al 2011), a prostaglandina E2, o fosfato glicerol e uma fam?lia de compostos da estatina (ZHANG, 2011). Os processos normais de repara??o s?o suficientes para boa parte das fraturas, no entanto, algumas situa??es exigem uma manipula??o e acelera??o no processo natural de repara??o. Alguns exemplos dessas situa??es incluem perda substancial de osso por trauma, ressec??o de tumor, artropatia, doen?a metab?lica e idade avan?ada (ATTAWIA et al., 2003; CANCEDDA et al., 2003). As estrat?gias terap?uticas utilizadas na repara??o ?ssea s?o a osteog?nese (transfer?ncia de c?lulas osteoprogenitoras), osteoindu??o (Estimulo para diferencia??o de c?lulas osteoprogenitoras em osteoblastos), osteocondu??o (materiais que fornecem a estrutura para as c?lulas formadoras de osso) e osteopromo??o (substancias, materiais ou est?mulo mec?nico capazes de melhorar o ambiente para forma??o ?ssea) (ATTAWIA et al. 2003). Por?m, os resultados dessas estrat?gias dependem da presen?a das CTMs (ATTAWIA et al., 2003; KRAUS; KIRKER-HEAD, 2006; BRUDER; FOX, 1999; MUSCHLER; MIDURA, 2002). Estudos com CTMs tem utilizado principalmente aspirado de medula ?ssea (KADIYALA et al., 1997; BRUDER, FINK, CAPLAN, 1994) e as t?cnicas de separa??o e isolamento s?o baseadas na centrifuga??o em gradiente de densidade e nas propriedades aderentes. As c?lulas nucleadas s?o separadas atrav?s de centrifuga??o, e ap?s cultivo as CTMs aderem ? garrafa e as demais c?lulas s?o removidas (CAPLAN, 1991; KADIYALA et al., 1997; BRUDER et al., 1998a) . As c?lulas podem ter seu potencial osteog?nico confirmado por meio de v?rias t?cnicas (YOO et al.,1998; KADIYALA et al., 1997; COOPER et al., 2001). No cultivo in vitro as CTMs purificadas na presen?a de dexametasona, acido asc?rbico e glicerofosfato tem progredido para uma linhagem osteobl?stica (JAISWAL et al.,1997; HAYNESWORTH et al.,1992). As c?lulas assumem uma forma osteobl?stica cuboidal e ocorre uma indu??o transiente de atividade de fosfatase alcalina (BRUDER et al., 1998b). Al?m disso, expressam prote?nas mRNAs de matriz ?ssea 14 levando-as a deposi??o de hidroxapatita-mineralizada, confirmando que essas c?lulas isoladas formam c?lulas ?sseas (JAISWAL, HAYNESWORTH, 1997; KADIYALA et al., 1997). Em 1998, Bruder et al. demonstraram que culturas de CTMs derivadas de MO, depositadas sobre plataformas de hidroxiapatita e sobre cer?mica de c?lcio, poderiam ser utilizadas no tratamento de defeitos cr?ticos no f?mur de c?es. Como resultados de suas pesquisas, constataram r?pido desenvolvimento de tecido ?sseo ao redor dos implantes e retorno precoce da fun??o do membro. Essa pesquisa encorajou diversos pesquisadores no mundo todo, que, posteriormente ? publica??o desses resultados, iniciaram pesquisas utilizando as c?lulas mesenquimais cultivadas. Com o mesmo intuito, Zamprogno (2007) trabalhando c?es, tamb?m realizou o tratamento de n?o uni?o utilizando CTMs cultivadas e expandidas em laborat?rio, na dose de 107 c?lulas/mL, realizando aplica??o ?nica percut?nea. Observou-se que a terapia com c?lulas-tronco provenientes da medula ?ssea mostrou-se efetiva para a estimula??o osteog?nica de n?o-uni?o de fraturas, promovendo a uni?o ?ssea em pacientes que apresentavam um ano ou mais de fratura e diversas cirurgias anteriores fracassadas. Em pesquisas com modelos animais, o grupo de pesquisa em repara??o tecidual da UFV, em parceria com o Laborat?rio de Imunogen?tica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), vem obtendo sucesso e demonstrando a contribui??o positiva do transplante de CTM aut?logas para a repara??o de falhas ?sseas e feridas cut?neas em camundongos diab?ticos (DEL CARLO et al., 2009). Guan et al. (2012) utilizou um ligante pepitideomim?tico espec?fico de alta afinidade para osso (LLP2A) anexado as CTMs em ratos osteop?nicos com falhas ?sseas com o objetivo de direcionar as CTMs para a superf?cie do osso. Uma ?nica inje??o intravenosa amentou a forma??o de osso trabecular e da massa ?ssea 3. Coleta e obten??o de c?lulas nucleadas de medula ?ssea 3.1 Medula ?ssea A medula ?ssea ? derivada do mesoderma embrion?rio e ? formada por uma popula??o de c?lulas-tronco hematopoi?ticas (CTHs), suportadas por um estroma 15 mesenquimal (ZUK et al., 2001). As CTHs s?o as ?nicas c?lulas do sistema hematopoi?tico que exibem extenso potencial proliferativo e capacidade de se diferenciar em todas as c?lulas do sistema linfo-hematopoi?tico. Esta caracter?stica se mantem continuamente, (GASPER, 2000; HERZOG et al., 2003). A linhagem celular hematopoi?tica e o estroma associado s?o dependentes e formam um sistema cooperativo. O estroma medular est? relacionado ? manuten??o de um microambiente no qual as CT-hematopoi?ticas se mant?m e a prog?nie diferenciada recebe os sinais necess?rios para a matura??o celular (SCHWINDT et al., 2005). A presen?a de c?lulas-tronco n?o hematopo?ticas na medula ?ssea foi primeiramente sugerida pelo patologista alem?o Julius Clonheim, em 1867. Seu trabalho levantou a possibilidade de que a medula ?ssea pudesse ser a fonte de fibroblastos que depositam fibras col?genas como parte do processo normal de reparo. No entanto, foi com os achados de Friedenstein et al., em meados de 1970, que essa teoria veio a ser comprovada com a descoberta das CTMs. Eles encontraram, em uma cultura de c?lulas da medula ?ssea, uma popula??o de c?lulas aderidas ao pl?stico das placas em forma de fuso, semelhantes a fibroblastos. Observaram tamb?m que essas c?lulas possu?am capacidade para se diferenciar em col?nias que lembravam pequenos dep?sitos de osso ou cartilagem (BYDLOWSKI et al., 2009) Em 1999 Gussoni et al., ao estudar camundongos MDX (portadores da distrofia muscular de Duchenne, doen?a muscular degenerativa causada por muta??es no gene da distrofina, uma prote?na da parede muscular) que tamb?m sofriam de atrofia medular ap?s terem sido irradiados. Os camundongos foram submetidos a um transplante de medula ?ssea de camundongos sadios. Al?m de terem sua medula ?ssea regenerada pelas c?lulas do doador, algumas semanas ap?s o transplante, os animais transplantados apresentaram at? 10% das fibras musculares contendo aquela prote?na. Isto indicava que c?lulas derivadas da medula ?ssea do doador haviam se incorporado ao m?sculo dos animais distr?ficos. Dois anos mais tarde, outro grupo conseguiu demonstrar que na medula ?ssea do camundongo existem c?lulas com uma enorme capacidade de diferencia??o in vivo. Quando injetadas em camundongos receptores, estas CTMs derivadas da medula ?ssea se diferenciaram em c?lulas epiteliais do f?gado, pulm?o, 16 trato gastrointestinal e pele, al?m de c?lulas hematopoi?ticas no receptor. Este trabalho representou uma grande quebra de paradigma, e levou v?rios grupos a explorarem a capacidade terap?utica das CTMs da medula ?ssea em doen?as n?o hematol?gicas (KRAUSE et al., 2001). As c?lulas derivadas da medula ?ssea s?o conhecidas como CTMs (CAPLAN, 1991) devido a sua alta capacidade de replica??o e diferencia??o em diversas linhagens celulares, como osteog?nica, condrog?nica, adipog?nica, tenog?nica e miog?nica (BRUDER et al., 1998b). Estas c?lulas progenitoras apresentam capacidade de auto-renova??o e diferencia??o em um ou mais tipos celulares especializados (BIANCO, ROBEY, 2001), sendo atribu?da a elas uma atividade multipotencial (JIANG et al., 2002). Al?m de CTMs os aspirados de MO cont?m algumas prote?nas bioativas provenientes das plaquetas de degranula??o que estimulam a regenera??o ?ssea (KRAUS, KIRKER-HEAD, 2006). Hoje, a principal fonte para o isolamento CTMS em mam?feros ? a MO (AICHER et al., 2011). C?lulas com potencial osteobl?stico t?m sido isoladas de uma variedade de esp?cies, incluindo humanos, (PITTENGER et al., 1999), ratos (NISHIMORI et al., 2006), coelhos (IM et al., 2001; YANAI et al., 2005) e c?es (BRUDER et al., 1998b). Os aspirados de MO foram considerados por serem mais acess?veis e proporcionarem fontes ricas em CTMs. (HU et al., 2003). A quantidade de CTMs representa uma fra??o pequena da popula??o total de c?lulas nucleadas da MO (PITTENGER et al., 1999). Apesar do n?mero dessas c?lulas serem limitadas na MO, a prolifera??o e expans?o das mesmas, sob condi??es adequadas s?o facilmente obtidas in vitro (KRAUS, KIRKER-HEAD, 2006). Um dos princ?pios utilizados na terapia celular para a repara??o ?ssea ? baseado na quantidade de CTMs obtidas de aspirados de MO, tendo sido obtido efeitos terap?uticos ben?ficos, sem necessitar de cultivo celular (KRAUS, KIRKER- HEAD, 2006) A idade do doador ? importante, sendo que a MO de jovens cont?m uma maior concentra??o de CTMs em rela??o aos adultos e idosos. Na MO fetal existem cerca de 25 vezes mais CTMs do que na MO de um adulto (PANEPUCI et al., 2004). As t?cnicas de isolamento e cultivo das CTMs da MO geralmente s?o baseadas nas propriedades aderentes (CAPLAN, 1991), sendo a centrifuga??o por 17 gradiente de densidade aplicada inicialmente para separar as c?lulas mononucleares (KRAUS, KIRKER-HEAD, 2006). 3.2. Pun??o aspirativa de medula ?ssea As indica??es usuais para a pun??o aspirativa de medula ?ssea costumavam incluir a presen?a de uma altera??o persistente de sangue perif?rico, uma neoplasia (leucemia), infec??o com potencial envolvimento da medula ?ssea, a identifica??o do est?gio de linfoma e hipercalcemia de origem n?o revelada, dentre outras (KATHLEEN, 2000). A medula ?ssea de equinos consiste em c?lulas precursoras, granul?citos, plaquetas e c?lulas de gordura (HERTHEL, 2002). Nos indiv?duos adultos, as c?lulas precursoras podem ser obtidas por pun??o da medula ?ssea, sendo poss?vel a realiza??o da t?cnica no esterno, costela, p?lvis, cr?nio, ?mero, f?mur e t?bia, pois nestes locais h? uma constante fun??o hematopoi?tica (SPEIRS, 1999; THOMAS, 2003). Em animais jovens ou de pequeno porte (c?es e gatos) a tuberosidade coxal ? o local de escolha para a obten??o de medula ?ssea, pois n?o h? ?rg?os adjacentes e o osso ? acess?vel abaixo da pele. No entanto, ? dif?cil obter amostras da tuberosidade coxal em equinos pela densidade e espessura ?sseas da regi?o (CAR, BLUE, 2000). Em equinos, o esterno ? o s?tio de escolha para a t?cnica, pois a atividade hematopoi?tica persiste na estern?bra por toda a vida do animal, os ossos s?o cobertos por massa muscular delgada, e a cavidade medular ? coberta por uma fina camada de osso, facilitando o acesso a esta regi?o. O esterno ? um osso segmentado e mediano, que completa o esqueleto do t?rax ventralmente e articula- se com as cartilagens das costelas esternais lateralmente. Ele consiste em um n?mero de seis segmentos ?sseos, as estern?bras, unidas por meio de cartilagem o indiv?duo jovem (GETTY, 1986). As desvantagens da pun??o deste local s?o a posi??o desconfort?vel e perigosa em que a pessoa que coleta a amostra ? for?ada a assumir e a relativa proximidade dos ?rg?os vitais, incluindo o cora??o (SPEIRS, 1999; THOMAS, 2003). 18 A medula ?ssea tamb?m pode ser coletada nas costelas de animais de grande porte, pois neste local tamb?m ? mantida a atividade hematopoi?tica atrav?s da vida, a medula est? dispon?vel pr?xima ? superf?cie do osso, e o coletor se posiciona de forma segura, durante o ato de pun??o. A ?nica desvantagem fica representada pela pequena superf?cie da costela, o que dificulta no assentamento da agulha para penetra??o na superf?cie do osso. ? frequente o deslizamento da agulha no osso, possibilitando sua penetra??o nos m?sculos intercostais e consequentemente na caixa tor?cica (ROSE, 1993). S?o recomendadas agulhas especiais para a coleta da medula ?ssea e dentre elas est?o inclu?das as agulhas modelo Rosenthal, Illinois sternal, e Jamshidi. A amostra deve ser coletada em solu??o anticoagulante (heparina ou EDTA) com o objetivo de evitar a forma??o de co?gulos (KATHELEEN, 2000) A conten??o correta e tranquiliza??o dos equinos minimiza as poss?veis complica??es relacionadas ao procedimento. A prepara??o cir?rgica do local de pun??o, o uso de instrumentos esterilizados, luvas e t?cnicas de assepsia minimizam o risco de infec??es iatrog?nicas. O cl?nico deve ser cuidadoso ao introduzir a agulha diretamente na estern?bra, para evitar a entrada na cavidade tor?cica. O risco de pneumot?rax, hemorragia incontrolada ou lacera??o card?aca pode ser diminu?do pelo uso da vigil?ncia e monitora??o da agulha utilizando aparelho de ultrassom durante o procedimento (MORRIS, WITHLOCK 1983, BARREIRA 2008). Enquanto alguns trabalhos destacaram o risco potencial de complica??es como pneumot?rax e pneumoperic?rdio, al?m da posi??o desconfort?vel e vulner?vel do pesquisador durante a coleta (DURANDO et al., 2006, MORRIS, WITHLOCK 1983, BARREIRA 2008), outros consideraram o procedimento extremamente simples (FORTIER et al., 1998; SMITH et al., 2003).Um caso de perfura??o de t?rax decorrente pun??o de MO em equinos foi relatado por Durando et al., (2006) e existem alguns relatos em humanos (ACKERMAN et al., 1958; BAKIR, 1963; GERDIN, 1980; JUAN, 2002; BHOOTRA, 2004) Contestando alguns autores que citam a necessidade de anestesia geral e dec?bito dorsal (HERTHEL 2002, THOMAS 2003), Speirs (1999), Ribeiro (2009), Smith et al., (2003), Barreira (2008), Alves et al., (2009), Fortier et al., (1998) citam que ? poss?vel realizar a pun??o do esterno do equino com o animal em esta??o e 19 somente sedado. Em ambas as situa??es, a agulha para coleta da medula ?ssea ? introduzida ap?s uma pequena incis?o realizada por bisturi. O osso ? estabilizado em uma m?o e press?o firme e movimentos de rota??o s?o utilizados para permitir a penetra??o da agulha no osso cortical. Uma vez firmemente assentado no osso, o mandril ? removido e uma seringa de 10 a 20 mL, com ou sem anticoagulante, ? utilizada para a aspira??o. A agulha da coleta deve ser deixada no local da seringa e o mandril recolocado enquanto os esfrega?os s?o preparados. Uma vez que material suficiente tenha sido obtido, a agulha ? removida e um ponto de sutura no local da incis?o de pele pode ser necess?rio. O ultrassom pode ser utilizado para a determina??o do local de pun??o (THOMAS, 2003; BARREIRA, 2008). O preparo dos esfrega?os de medula ?ssea merece cuidadosa aten??o, porque mesmo a coleta mais especializada pode ser improdutiva, se o esfrega?o for de m? qualidade. Caso n?o tenha sido utilizado anticoagulante na coleta, as l?minas devem ser preparadas imediatamente e, quando presente, o esfrega?o pode ser realizado at? uma hora ap?s a coleta (KATHLEEN, 2000). Os esfrega?os devem ser rapidamente secos ao ar para melhor manuten??o da morfologia celular. Diferentes corantes, como o de Romanowsky ou hematoxilina e eosina, podem ser utilizados na avalia??o de rotina da medula ?ssea aspirada. A concentra??o dos corantes precisa ser aumentada quando comparada ? concentra??o utilizada para corar esfrega?os de sangue perif?rico e esta concentra??o depende da celularidade do aspirado de medula ?ssea e da espessura da prepara??o dos esfrega?os (BARTL, 1984; KATHLEEN, 2000).Se o material da seringa incluir anticoagulante, expeli-lo numa placa de Petri ? indicado para a observa??o das esp?culas de medula e a presen?a destas sugere a origem medular da amostra obtida durante a pun??o. As esp?culas de medula s?o observadas como fragmentos cinzas, opacos, de forma irregular, que se grudam no fundo da placa quando esta ? inclinada. Elas geralmente s?o distingu?veis de gl?bulos de gordura claros, brilhosos e esf?ricos (KATHLEEN, 2000). Woster et al. (2000) trabalhando com aspirado medular de tr?s cavalos, embora tenham utilizado um volume inicial fixo de 30 ml, obtiveram numero total de c?lulas nucledas com valor diferente entre os animais (18,8 x 106, 1,87 x 106 e 4,85 x 106). A raz?o para a variabilidade individual ainda ? desconhecida, mas ? poss?vel que a idade e a massa corporal possam interferir no n?mero de c?lulas-tronco 20 presente nos tecidos (VIDAL et al., 2007). A idade tem sido relatada como inversamente proporcional ao n?mero de c?lulas-tronco mesenquimais derivadas da medula ?ssea em humanos, mas ainda existem conflitos na literatura (AUST et al., 2004). 3.3. Separa??o da FCM da MO de equinos A medula ?ssea de humanos e animais ? composta por muitos constituintes celulares, dentre os quais existe uma fra??o de c?lulas mononucleares representadas principalmente pelas CTHs, blastos, mon?citos e linf?citos, al?m de uma rara popula??o de c?lulas multipotenciais, as CTMs. Para que se possa realizar a purifica??o de CTHs ou CTMs, ou ainda trabalhar cl?nica ou experimentalmente com a pr?pria fra??o de c?lulas mononucleares, ? necess?rio realizar os procedimentos para separa??o desta fra??o dos outros constituintes da medula ?ssea (FONTES et al,. 2006). De forma breve, o procedimento de separa??o da fra??o mononuclear, originalmente descrito por Boyum (1968) tem como objetivo a separa??o celular atrav?s do gradiente de densidade Ficoll-Hypaque 1.077g/mL. A solu??o de Ficoll ? constitu?da por uma mistura de pol?meros de carboidratos Ficoll e composto iodado de metrizamida. Ap?s centrifuga??o a baixa velocidade, as hem?cias e os leuc?citos granul?citos atravessam a fase org?nica (Ficoll-Hypaque) e sedimentam, as c?lulas mononucleares localizam-se entre as duas solu??es, enquanto as plaquetas e as prote?nas plasm?ticas localizam-se na fase aquosa. Em geral, o procedimento inicia- se com a dilui??o do sangue em solu??o salina tamponada (phosphate buffer saline ? PBS), o qual ? transferido para o tubo c?nico tipo Falcon. Em seguida ? adicionada lentamente a solu??o de gradiente Ficoll-Hypaque ao fundo do tubo. A separa??o de c?lulas sangu?neas ocorre ? temperatura ambiente e ap?s centrifuga??o a 700g por 30 minutos. Ap?s esse processo, observa-se uma anel celular entre as fases org?nica (Ficoll-Hypaque, fase inferior) e aquosa (fase superior), onde est?o presentes as c?lulas mononucleares. Desta forma, as c?lulas mononucleadas s?o coletadas cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur, transferidas a outro tubo, submetidas ? lavagem em salina e em seguida ressuspendidas em pequeno volume de PBS para posterior contagem em c?mara de Neubauer. 21 A FCM pode ser isolada do aspirado de MO de equinos utilizando t?cnicas semelhantes ?s utilizadas em outras esp?cies (SMITH et al., 2003). Por?m, segundo Alves et al. (2009) o protocolo de coleta e isolamento dessas c?lulas nas t?cnicas j? descritas em outras esp?cies necessita de adapta??es, pois os cavalos apresentam r?pida coagula??o do sangue medular e formam agregados celulares mesmo na presen?a de anticoagulante. Caracter?stica que dificultou a aspira??o e pode ter influenciado de maneira negativa na qualidade da amostra. 4. Utiliza??o cl?nica e experimental da FCM de MO na repara??o ?ssea Terapias alternativas, que auxiliem na recupera??o de fraturas, s?o muito importantes, pois podem minimizar o tempo de tratamento e os custos, e garantir o retorno mais r?pido ?s atividades normais (DOUAT, 2004). Calcula-se que s?o necess?rias 70 milh?es de CTMs para produzir um cent?metro c?bico de osso (MUSCHLER, MIDURA, 2002). A habilidade de aspirados de MO em forma??o ?ssea foi sugerida por Goujon, em meados de 1869. Estudos subsequentes com animais demonstraram que a medula ?ssea aut?loga cont?m c?lulas progenitoras osteog?nicas, as quais contribuem para a produ??o de osso (CONNOLY et al., 1989) e cartilagem (TOH et al., 2005). Estudos em vivo tamb?m tem documentado o potencial osteog?nico das CTMs em isolados de FCM e ap?s expans?o em cultivo celular (BRUDER, JAISWAL, HAYNESWORTH, 1997; BRUDER et al., 1998b; BARROS et al., 2001a e b; PORTINHO et al., 2006; DEL CARLO et al., 2007; PAEZ et al., 2007; DALLARI et al., 2007; YAMASAKI et al., 2008; CROVACE et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2010). Modelos experimentais de defeitos ?sseos tratados com c?lulas mononucleares t?m demonstrado que ambientes biol?gicos e mec?nicos favor?veis resultam em prolifera??o e diferencia??o de CTMs em osteoblastos e condr?citos, e que a presen?a de c?lulas-tronco em defeitos ?sseos experimentais diminui o tempo de repara??o do defeito ?sseo (KRAUS, KIRKER-HEAD, 2006). A presen?a de material de suporte ? indispens?vel quando se necessita reconstituir tecido ?sseo adulto. As especifica??es ideais desse material s?o contradit?rias, por?m, geralmente, considera-se que este deva ser biocompat?vel, 22 osteocondutor, resistente, reabsorv?vel, poroso, radiotransparente e male?vel (POTIER, PETITE, 2005). Um enxerto que fornece e mant?m c?lulas formadoras de osso ? chamado osteog?nico. A forma??o ?ssea exige o material celular para fabricar seus componentes estruturais (ATTAWIA et al., 2003). O enxerto ?sseo aut?geno ? um ?timo exemplo de um enxerto osteog?nico e ? o padr?o ouro de material regenerativo ?sseo. O auto-enxerto esponjoso fornece uma mistura de c?lulas de linhagem osteobl?stica altamente diferenciadas de revestimento do osso esponjoso e CTMs indiferenciadas no componente da medula. As CTMs podem responder aos est?mulos biol?gicos e mec?nicos do local, se diferenciando em qualquer componente celular necess?rio na uni?o ?ssea secund?ria, dessa forma oferecem um grande potencial de cura ?ssea para uma variedade de situa??es (YOO, JOHNSTONE, 1998). Outro exemplo de enxerto osteog?nico ? aquele oriundo de aspirado de medula ?ssea, que cont?m CTMs que j? comprovaram seu efeito osteog?nico e algumas prote?nas biologicamente ativas que estimulam a repara??o ?ssea de maneira semelhante ao que ocorre naturalmente no co?gulo da fratura, muitas s?o provenientes das plaquetas de degranula??o presentes na FCM. No entanto, o aspirado de medula ?ssea n?o apresenta a mesma magnitude de osteog?nese observado com o enxerto do osso esponjoso por algumas raz?es, entre elas, resultados vari?veis de qualidade do aspirado dependendo da t?cnica e do paciente (MUSCHLER et al., 2001, MUSCHLER et al., 2003), a quantidade de c?lulas osteoprogenitoras pode ser baixa, e o mais importante, a medula ?ssea n?o tem o material de suporte necess?rio ou material osteocondutor para ser eficaz por si s? (KRAUS, KIRKER-HEAD, 2006). Uma das quest?es fundamentais sobre o enxerto de FCM de MO ? a import?ncia do n?mero real ou a porcentagem de c?lulas-tronco de doadores no tecido receptor. Ainda n?o est? claro se as CTMs se diferenciam como c?lulas do tecido de repara??o, por exemplo, como os mi?citos card?acos em modelos de infarto do mioc?rdio, ou se eles est?o auxiliando por sintetizar e secretar fatores de crescimento que est?o melhorando a fun??o do tecido. Grande parte do debate do ponto de vista cl?nico ? justamente o alcance da recupera??o funcional, por?m algumas quest?es ainda devem ser compreendidas e comprovadas por ensaios pr?- 23 cl?nicos e cl?nicos, e dessa forma refinar a utiliza??o de enxertos de CTM?s (FORTIER, 2005). O processo de isolamento de c?lulas nucleadas aumenta a concentra??o de CTMs para o implante direto, sendo a que a concentra??o de CTMs segundo Zago e Covas (2006) e Pittenger et al., (1999) varia entre 0,001% a 0,01% do total de c?lulas nucleadas. Contrariando esses n?meros, Fortier (2010) Avaliou a FCM de MO por citometria de fluxo, e encontrou aproximadamente 15 % de CTMs na FCM de MO de equinos. Tamb?m foi poss?vel notar que no centrifugado cont?m um grande n?mero de plaquetas que s?o reservat?rios naturais do corpo de v?rios fatores de crescimento, tais como IGF-I, TGF-B, FGF. Estes s?o conhecidos por aumentar a s?ntese da matriz da cartilagem, osso e tend?o. A autora indicou acrescentar trombina a FCM com o objetivo de clivar o fibrinog?nio em fibrina e formar um suporte osteocondutor garantindo o meio necess?rio para as CTMs e os fatores de crescimento. Este m?todo tem a vantagem de ser uma t?cnica onde o per?odo de cultura no laborat?rio n?o ? necess?rio, al?m disso, ? completamente aut?geno, e oferece todos os tr?s componentes em que se acreditam ser importante para a regenera??o: c?lulas, fatores de crescimento e um suporte estrutural osteocondutor. O uso da FCM para o tratamento de les?es ortop?dicas tem a vantagem de poder ser realizada no momento do diagn?stico da les?o, com menor tempo de preparo e custo baixo (ALVES et al., 2009). A t?cnica de inje??o de MO via percut?nea ? relativamente simples, de custo moderado e minimiza as complica??es advindas da imobiliza??o prolongada do membro (CONNOLLY et al., 1989; CONNOLLY, 1995). Segundo Garg et al. (1993), esse procedimento determina trauma m?nimo, evita intercorr?ncias no s?tio receptor e pode ser repetido facilmente. Numerosos estudos de enxertia em s?tio aberto de medula ?ssea (MO) aut?gena total em animais de laborat?rio e aquelas realizadas com aspirados de MO de c?es e coelhos demonstraram que ela ? um efetivo enxerto osteog?nico por si s? e em combina??o com outros materiais (URIST et al., 1979; TAKAGI, URIST, 1982) Numa pesquisa pioneira, iniciada em 1998 e publicada no ano de 2001, Barros et al. (2001a;b) realizaram a aplica??o percut?nea de c?lulas mononucleares 24 da medula ?ssea na repara??o de falhas experimentais realizadas em r?dio de coelhos, obtendo resultados significativos no processo de repara??o ?ssea em rela??o ao grupo controle. Os autores puderam concluir que a aplica??o de FCM resultou em preenchimento precoce com forma??o direta de tecido ?sseo, quando comparado com o controle, sobretudo nas duas primeiras semanas de avalia??o. Del Carlo et al. (2007),l Dallari et al. (2007) e Crovace et al. (2008) utilizaram a FCM de MO aut?genas, via aplica??o in situ, em falhas ?sseas cr?ticas em modelos experimentais animais, visando precocidade de osteog?nese, e obtiveram resultados similares a Barros et al.(2001b). Yamasaki et al.(2008) realizaram osteotomia rotacional transtrocant?rica acrescida da aplica??o aut?gena de FCM associadas ? hidroxiapatita, no tratamento de osteonecrose bilateral da cabe?a femoral e conclu?ram que a aplica??o das c?lulas favoreceu a repara??o. De forma similar, Paez et al. (2007) associou FCM ao substituto ?sseo coral Porites astreoides e constataram sustenta??o para crescimento e forma??o ?ssea precoce. Portinho et al. (2006) comparou a reconstru??o de calotas cranianas utilizando de osso liofilizado bovino (OL) associado a CTMs cultivadas em uma concentra??o de aproximadamente 5x10? e apenas OL. O autor concluiu que do ponto de vista histol?gico os enxertos contendo CTMs apresentaram resultados melhores quando comparados aqueles sem combina??o de c?lulas. O emprego das CTMs pode significar na melhoria dos enxertos ?sseos e uma otimiza??o no tempo para integra??o desses enxertos. Da mesma forma Oliveira et al. (2010) avaliou a utiliza??o de esponja de gelatina embebida em FCM isoladamente e FCM associada a prote?na ?ssea morfogen?tica na cicatraza??o de defeito ?sseo experimental na t?bia de c?es. Em ambos os casos observando crescimento ?sseo acelerado, sendo uma alternativa favor?vel ao crescimento ?sseo em defeitos agudos experimentais em t?bias de c?es. Hernigou et al. (2005) trataram n?o-uni?o ?ssea, na di?fise da t?bia, utilizando a fra??o concentrada de FCM, aplicada por via percut?nea. Observaram revers?o da n?o-uni?o e consolida??o ?ssea em 88% dos casos e o sucesso do tratamento era proporcional ? concentra??o celular obtida. Zamprogno (2007) realizou, no tratamento de n?o-uni?o em c?es, aplica??o ?nica de cultura de CTMs, por via percut?nea, na dose de 107 c?lulas por aplica??o Observou que a terapia com 25 c?lulas-tronco provenientes da medula ?ssea mostrou-se efetiva, promovendo a uni?o ?ssea em pacientes que apresentavam um ano ou mais de fratura, e diversas cirurgias anteriores fracassadas. Destacando a aplica??o alog?nica, Horwitz et al. (2002) realizaram duas infus?es venosas de MSCs, na dose de 1? 106 c?lulas/kg a 5?108 c?lulas/kg, com intervalos de um m?s entre as aplica??es, objetivando o tratamento de seis crian?as que sofriam de severas formas de osteog?nese imperfeita. Durante os primeiros seis meses de acompanhamento, observaram maior deposi??o ?ssea e menor ocorr?ncia de fraturas nesses pacientes. Por?m, de acordo com outros relatos, um inconveniente para a aplica??o venosa ? a necessidade de grandes quantidades de c?lulas por aplica??o, visto que muitas se distribuem para locais distintos ? les?o principal. REFER?NCIAS AICHER, W.K., et al. Regeneration of cartilage and bone by de!ned subsets of mesenchymal stromal cells - Potential and pitfalls. Advanced Drug Delivery Reviews. v. 63, p. 342?351, 2011. ACKERMAN, J.L., ALDEN, J.W. Pneumopericardium following sternal bone marrow aspiration; a case report. Radiology, v. 70 p. 408?409, 1958. ALISON, M.R. Stem cells in pathobiology and regenerative medicine. Journal of Pathology, v. 217, p.141-143, 2009. ALVES, A.L.G, VIEIRA, M.E.M, BARREIRA, A.P.B., et al. Protocolo de isolamento de c?lulas mononucleares de medula ?ssea de equinos. Vet. e Zootec, v. 16, p. 650- 655, n.4 out., 2009. ATTAWIA, M., KADIYALA, S., FITZGERALD, K., et al. Cell-based approaches for bone graft substitutes. In: LAURECIN, C.T. (editor). Bone Graft Substitutes. 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O objetivo deste estudo foi avaliar a t?cnica de coleta de medula ?ssea (MO) de equinos em esta??o e do isolamento da fra??o de c?lulas mononucleadas (FCM) de MO. Foram utilizados seis equinos, quatro f?meas e dois machos, sem ra?a definida, com peso m?dio de 248 kg e idade entre 1,5 e 10 anos. A MO foi aspirada do osso esterno de cada equino entre a 4? e 5? esternebra. Para evitar a forma??o de co?gulos na cavidade medular e no trajeto da agulha, esta foi lavada com solu??o heparinizada (5000UI/10mL) e 10 ml da mesma solu??o foi injetada no interior da cavidade medular antes da aspira??o da amostra. Do material aspirado foi isolado a FCM por meio de centrifuga??o e separa??o em gradiente de concentra??o Ficoll-Hypaque. As amostras foram coradas com azul de Trypan para contagem de c?lulas nucleadas e determina??o da viabilidade celular. A coleta de medula mostrou-se um m?todo de baixo custo e pass?vel de ser realizado rotineiramente. A inje??o de heparina parece ter influenciado de maneira favor?vel na coleta. O m?todo de isolamento utilizado apresentou resultados semelhantes aos de outros estudos com equinos e em outras esp?cies. A m?dia de c?lulas nucleadas obtidas ap?s isolamento foi de 7,1 x 10? c?lulas/mL, a de c?lulas-tronco mesenquimais calculada foi de 710 c?lulas/mL e a viabilidade celular m?dia foi de 86,2%. PALAVRAS-CHAVE: coleta de medula ?ssea, fra??o celular mononuclear, terapia celular, repara??o ?ssea em equinos. ABSTRACT [Mesenchymal stem cells from bone marrow in IV metacarpal bone repair in horses. I. collection and isolation.] The mesenchymal stem cells (MSCs) have been extensively studied in tissue repair in multiple species. In horses they are a promising source for the treatment of 42 musculoskeletal diseases. The aim of this study was to evaluate the collection of bone marrow (BM) in horses in standing position and its mononuclear cells fraction (MCF) isolation. We used six horses, mixed breed, with an weight average of 248 kg and age between 2 and 10 years. The BM was aspirated from the sternum of each animal. To prevent clot formation in the medullary cavity and in the needle, the sternum cavity was flushed with 10 ml of heparin solution (5000UI/10mL) previously. The MCF was isolated from aspirated material by centrifugation and concentration gradient separation using Ficoll Hypaque. The samples were stained with Trypan blue for nucleated cell count and measurement of cell viability. The bone marrow collection proved to be a inexpensive procedure and it can be made routinely. The injection of heparin have favorably influenced the collection. The isolation method showed similar results to other studies in horses and other species. The average number of nucleated cells obtained after isolation was 7.1 x 10? cells/mL, the mesenchymal stem cells number was calculated at 710 cells/mL and the average cell viability was 86.2%. KEYWORDS: bone marrow collection, mononuclear cell fraction, cellular therapy, equine bone repair. INTRODU??O As c?lulas-tronco (CTs), presentes em todos os vertebrados, s?o c?lulas indiferenciadas, capazes de auto-renova??o e diferencia??o em m?ltiplas linhagens de c?lulas e tecidos, respons?veis pela auto-repara??o tecidual. Durante o desenvolvimento do pr?-embri?o s?o encontradas c?lulas totipotentes e pluripotentes, chamadas de embrion?rias (CTE). Nos tecidos adultos, s?o encontradas c?lulas-tronco multipotentes, denominadas adultas (CTA) ou som?ticas (CTS) (DEL CARLO et al., 2008). Dentre as CTS encontram-se as c?lulas-tronco mesenquimais (CTMs), com ampla plasticidade e capacidade de migra??o para locais de les?o tecidual e de promover a manuten??o e regenera??o de m?ltiplas linhagens de c?lulas do organismo (SOTIROPOULOU et al., 2006; NAUTA, FIBBE, 2007). As CTMs est?o presentes em pequenas quantidades em todos os tecidos adultos, incluindo a medula ?ssea (MO), tecido adiposo, peri?steo, tecido muscular e 43 ?rg?os parenquimatosos. Essas c?lulas caracterizam-se pela habilidade de produzir qualquer tipo celular necess?rio num processo de repara??o, como osteoblastos, condroblastos, hepat?citos, c?lulas epiteliais, renais, card?acas, entre outros. Tal plasticidade possibilita perspectivas terap?uticas promissoras com esse grupo celular, tornando-o foco de pesquisas em todo o mundo (PITTENGER et al., 1999; ZAGO, COVAS, 2006). As CTMs s?o coletadas principalmente da MO, tecido adiposo e de ?rg?os parenquimatosos (CROVACE et al., 2008). A MO ? a forma tradicional pela qual se obt?m c?lulas de um doador para um transplante. O material obtido ? bastante heterog?neo e cont?m uma grande diversidade de c?lulas, incluindo c?lulas maduras do sangue, linf?citos, fragmentos do estroma, gordura, c?lulas-tronco hematopoi?ticas e uma pequena quantidade de CTMs (ZAGO, COVAS, 2006; CROVACE et al., 2008). Em equinos, o esterno ? o s?tio de escolha para a coleta, pois a atividade da MO persiste na est?rnebra por toda a vida do animal, os ossos s?o cobertos por massa muscular delgada, e a cavidade medular ? coberta por uma fina camada de osso, facilitando o acesso a esta regi?o. As desvantagens da pun??o deste local s?o a posi??o desconfort?vel e perigosa em que a pessoa que coleta a amostra ? for?ada a assumir e a relativa proximidade dos ?rg?os vitais, incluindo o cora??o (SPEIRS, 1999; THOMAS, 2003; BARREIRA et al., 2008b). Alguns autores (HERTHEL, 2002; THOMAS, 2003), descrevem a necessidade de anestesia geral e dec?bito dorsal para a coleta de MO, mas segundo Speirs (1999), Ribeiro (2009), Smith et al. (2003), Barreira et al. (2008b) e Alves et al. (2009), ? poss?vel realizar a pun??o do esterno do equino, com o animal em esta??o e sedado. Em ambas as situa??es, a agulha utilizada para a coleta de medula ?ssea deve ser introduzida ap?s uma pequena incis?o de pele e musculatura realizada por meio de bisturi. A penetra??o no osso cortical ? obtida por press?o firme e movimentos de rota??o. Uma seringa de 10 a 20 mL, com ou sem anticoagulante, pode ser utilizada para a aspira??o (THOMAS, 2003; BARREIRA et al., 2008b). A conten??o correta e a tranquiliza??o dos equinos, assim como, a prepara??o cir?rgica do local de pun??o, o uso de instrumentos esterilizados, luvas e t?cnicas de assepsia minimizam o risco de infec??es iatrog?nicas e demais complica??es relacionadas ao procedimento. O ultra-som pode ser utilizado para a 44 determina??o mais precisa do local de pun??o (THOMAS, 2003; BARREIRA et al., 2008b) e tamb?m para vigil?ncia e monitora??o da agulha durante o procedimento, diminuindo o risco de pneumot?rax, hemorragia incontrolada ou lacera??o card?aca (MORRIS, WITHLOCK, 1983; BARREIRA et al., 2008b). A MO pode ser utilizada como fonte de CTMs diretamente ou pode ser processada para concentra??o dessas c?lulas. Dentre as formas de processamento, a centrifuga??o em gradiente de Ficoll-Hypaque para obten??o de FCM foi utilizada em alguns estudos obtendo uma quantidade e qualidade celular adequada. Por?m, segundo Alves et al. (2009) o protocolo de coleta e isolamento dessas c?lulas nas t?cnicas j? descritas em outras esp?cies necessita de adapta??es, pois cavalos apresentam r?pida coagula??o do sangue medular e formam agregados celulares mesmo na presen?a de anticoagulante. A FCM pode ser utilizada diretamente na les?o ou pode-se realizar o isolamento e expans?o das CTMs, por meio de cultivo in vitro (ZAGO, COVAS, 2006; CROVACE et al., 2008). O uso da FCM para o tratamento de les?es ortop?dicas apresenta algumas vantagens em rela??o ? terapia com CTMs ap?s cultivo celular, como a utiliza??o logo ap?s o diagn?stico da les?o e um menor custo e tempo de preparo (ALVES et al., 2009). O processo de isolamento de c?lulas nucleadas aumenta a concentra??o de CTMs na FCM para o implante direto, obtendo uma concentra??o de 0,001% a 0,01% (FORTIER, SMITH, 2008; ZAGO, COVAS, 2006). O objetivo deste estudo foi avaliar a t?cnica de coleta de medula ?ssea (MO) em equinos em esta??o e do processo de isolamento de fra??o de c?lulas mononucledas (FCM) de MO nesta esp?cie. MATERIAIS E M?TODOS O experimento foi realizado no Hospital-Escola de Grandes Animais da FAV/UNB em parceria com o Laborat?rio de Reprodu??o e Biotecnologia do Instituto de Biologia (CFS IB/UNB). Foram utilizados seis equinos SRD provenientes do Setor de Apreens?o da SEAGRI/DF, sendo quatro f?meas e dois machos, com peso m?dio de 248 Kg e idade aproximada variando de 1,5 a 10 anos. Os animais foram submetidos a exame cl?nico, hemograma e bioqu?mica s?rica, comprovando assim, 45 seu estado de higidez pr?vio ao experimento. Este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comit? de ?tica no Uso Animal da Universidade de Bras?lia (CEUA- UnB), sob processo UnBDOC n? 48461/2010, por estar de acordo com os princ?pios ?ticos do Col?gio Brasileiro de Experimenta??o Animal (COBEA). O local de escolha para coleta da amostra medular foi o osso esterno de cada equino. Durante a coleta, os animais foram mantidos em esta??o e contidos em bretes. Realizou-se tricotomia de uma ?rea de aproximadamente 5 x 20cm na regi?o do esterno para exame ultra-sonogr?fico e identifica??o do local ideal para pun??o, entre a 4? e a 5? estern?bras. Os animais foram sedados com detomidina (40mcg/Kg), e em seguida, procedeu-se a anestesia local com 5 ml de lidoca?na no ponto da coleta. A agulha de pun??o de MO em equinos utilizada foi a do modelo Jamshidi de calibre 8G e 12 cm de comprimento, sendo sempre previamente lavada com solu??o heparinizada (5000UI/10mL) para evitar a forma??o de co?gulos no trajeto da agulha durante o procedimento. Ap?s incis?o de pele e musculatura, a agulha de pun??o de MO foi introduzida no sentido ventro-dorsal perpendicular ? pele, com auxilio de movimentos de press?o e rota??o. Uma vez bem fixa a agulha na cavidade medular do esterno, foi retirado o mandril, e foi feita a tentativa de aspira??o. No momento em que se conseguiu aspirar algum conte?do da MO foram injetados 10 mL de solu??o heparinizada (5000UI/10mL), com o objetivo de evitar a forma??o de co?gulos dentro da cavidade medular. Ap?s trinta segundos iniciou-se a aspira??o da MO com aux?lio de uma seringa de 60mL. Parte da primeira al?quota foi expelida em l?mina de microscopia para a verifica??o a olho nu da presen?a de esp?culas ?sseas e gl?bulos de gordura, sugerindo a origem medular da amostra. Para cada amostra obtida foram feitos esfrega?os, do tipo squash, que posteriormente foram corados pelo m?todo Romanowsky e avaliados em microsc?pio ?ptico, quanto ? presen?a de precursores hematopoi?ticos. A presen?a destes confirma a origem medular, enquanto a predomin?ncia de hem?cias e c?lulas maduras indica tratar-se de amostra de sangue perif?rico. Foram coletados entre 20 e 25 mL de aspirado de MO. As amostras foram identificadas, acondicionadas em gelo e encaminhadas ao laborat?rio, onde a fra??o de c?lulas mononucleares (FCM) da MO foi isolada . 46 Figura 1. A - Regi?o contendo c?lulas mononucleadas obtidas ap?s centrifuga??o em Ficoll-Hypaque. Note um halo esbranqui?ado em suspens?o localizado entre o plasma e a por??o contendo erit?citos com Ficoll-Hypaque (seta). B - Pellet obtido ao final do processo de isolamento. O isolamento da FCM ocorreu no interior de uma capela de fluxo laminar previamente desinfetada com ?lcool 70% e luz ultravioleta. A amostra foi dilu?da em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) na propor??o de 1:1, em seguida foi cuidadosamente depositada sobre Ficoll-Hypaque (? = 1.077 g/mL) na propor??o de 2:1. A amostra foi, ent?o, centrifugada a 500g por 30min com o objetivo de realizar a separa??o de seus constituintes por gradiente de concentra??o. Ap?s centrifuga??o, observou-se a separa??o das c?lulas mononucleares da MO, vis?veis na forma de um halo esbranqui?ado em suspens?o localizado entre o plasma e a por??o contendo erit?citos com Ficoll-Hypaque (figura 1 - A, seta). Essa camada foi cuidadosamente retirada por meio de pipeta autom?tica e submetida a dois processos de lavagem com DMEM com o objetivo de retirar o restante de Ficoll- Hypaque da amostra. Cada lavagem foi conduzida diluindo o conte?do final novamente em DMEM na propor??o de 1:1 e centrifugando a 500g por 10min. Ao A B 47 t?rmino das lavagens, foi obtido na por??o final do tubo, um pellet contendo a FCM da MO (figura 1 ? B). Este pellet foi, ent?o, resuspendido em DMEN at? o volume total de um mL. Utilizando uma pipeta autom?tica, retirou-se uma al?quota de 50?L da amostra para quantifica??o de c?lulas nucleadas e para o teste de viabilidade celular utilizando o corante Azul de Trypan 1% em C?mara de Neubauer. O estudo da celularidade e da viabilidade celular foi realizado em microsc?pio ?ptico, fazendo- se a contagem de c?lulas mortas, coradas, e c?lulas vivas, n?o coradas. Para o c?lculo do n?mero aproximado de CTMs foi utilizada a estimativa de uma dessas c?lulas para cada 100.000 de c?lulas nucleadas (CONNOLLY, 1995). RESULTADOS A coleta de MO do osso esterno com os animais sedados e contidos em bretes mostrou-se vi?vel e diminuiu riscos relacionados ? anestesia geral. A seda??o com detomidina (40mcg/Kg) aliada ao bloqueio anest?sico foi sufiente para realiza??o de tal procedimento. N?o foram observadas manifesta??es de dor, apesar do tamanho da agulha e da extensa penetra??o de tecido ?sseo (figura 2). Figura 2. Agulha para pun??o de MO modelo Jamshidi, de calibre 8G e 12 cm de comprimento, introduzida na quinta estern?bra. 48 O esterno dos equinos mais jovens apresentou maior facilidade de penetra??o da agulha em rela??o ao dos mais velhos. No animal mais jovem do grupo ocorreu perfura??o da cavidade tor?cica, com consequente ruptura de vasos coron?rios e ?bito. A frequ?ncia dessa complica??o foi de 16,6%, com intervalo de confian?a de 95% calculado de acordo com a distribui??o binomial exata variando entre 0,4% e 64,1%. O local da coleta, no espa?o entre a 4? e a 5? estern?bra, foi facilmente identificado no exame ultrassonogr?fico. Em todos os animais foi obtido o volume m?nimo desejado de aspirado de MO de 20 mL com relativa facilidade (figura 3 - A). Apenas em um animal foi necess?rio uma segunda pun??o entre a 3? e a 4? estern?bras, pois na primeira coleta n?o se conseguiu aspirar conte?do medular. A apar?ncia macrosc?pica das amostras coletadas foi semelhante em todas as amostras, apresentando colora??o escura, com gr?nulos acinzentados (esp?culas ?sseas) e gl?bulos de gordura sugerindo a presen?a de MO (figura 3 ?B). A confirma??o da origem das amostras foi obtida pela an?lise microsc?pica das l?minas de esfrega?o coradas pelo m?todo Romanowsky. Em todas as amostras foram observadas c?lulas imaturas caracterizadas como precursores hematopoi?ticos, confirmando assim, a origem de MO das amostras. A lavagem da seringa com solu??o heparinizada (5.000 UI/mL) e a inje??o de 10 mL dessa solu??o na cavidade medular foi capaz de evitar a forma??o de agregados celulares e consist?ncia gelatinosa da amostra, relatada como uma das poss?veis complica??es durante a coleta por Alves et al. (2009). Os resultados da contagem e viabilidade celular da FCM isolada do aspirado de MO e os valores calculados de c?lulas-tronco mesenquimais est?o expressos na Tabela 1. A m?dia da contagem de c?lulas nucleadas ap?s o isolamento foi de 7,1 x 10? c?lulas/mL, a m?dia de c?lulas-tronco mesenquimais foi aproximadamente de 710 c?lulas/mL e a viabilidade celular m?dia foi de 86,2%. 49 Figura 3. A - Aspira??o do conte?do de MO com seringa de 60 ml. B - Parte da primeira al?quota de MO aspirada, que foi expelida em placa de Petri para a verifica??o macrosc?pica da presen?a de esp?culas ?sseas e gl?bulos de gordura (setas), sugerindo a origem medular da amostra. Tabela 2. Contagem de c?lulas da fra??o mononuclear (FCM) obtidas em 20 mL de medula ?ssea, quantidade de c?lulas-tronco mesenquimais presentes na FCM (valor calculado) e viabilidade de c?lulas da FCM. Animal Idade (anos) Quantidade de c?lulas da FCM da medula ?ssea C?lulas-tronco mesenquimais (valor calculado) Viabilidade celular da FCM (% de c?lulas vivas) 01 2,5 14,0 x 10? 1400 88% 02 3,5 10,2 x 10? 1020 94% 03 10 4,1 x 10? 410 94% 04 8 4,4 x 10? 440 73% 05 3,5 2,8 x 10? 280 82% M?dia 5,5 7,1 x 10? 710 86,2%. B A 50 DISCUSS?O A t?cnica de coleta de MO do osso esterno com o equino em esta??o, tamb?m descrita por Woster et al. (2000), Alves et al. (2009) e Ribeiro (2009), mostrou-se uma t?cnica pass?vel de ser realizada. Coincidindo com o relatado por Barreira et al. (2008b), e contrariando o relatado por Ribeiro (2009), a seda??o foi indispens?vel mesmo ap?s anestesia local. A tranquiliza??o al?m de diminuir a movimenta??o dos animais e evitar rea??es indesejadas, tornou o procedimento mais seguro. A complica??o descrita nesse estudo demonstra que a coleta de MO apresenta riscos que devem ser considerados principalmente quando animais jovens est?o sendo submetidos ao procedimento, devido ? baixa resist?ncia para a introdu??o da agulha e ? menor espessura das estruturas compactas do osso esterno. O amplo intervalo de confian?a referente ? frequ?ncia obtida dessa complica??o (0,4% e 64,1%), n?o permite tirar conclus?es precisas quanto ? frequ?ncia real de perfura??o card?aca e seguran?a da t?cnica utilizada. A perfura??o tor?cica e pneumoperic?rdio ap?s pun??o de esterno em equinos j? haviam sido relatados por Durando et al. (2006) ap?s coleta de MO em um equino submetido a anestesia geral e posicionado em dec?bito dorsal. Alguns casos semelhantes em humanos tamb?m j? haviam sido descritos (ACKERMAN et al., 1958; BAKIR, 1963; GERDIN, 1980; JUAN et al., 2002; BHOOTRA, 2004). A t?cnica de coleta em equinos na posi??o quadrupedal em localidades craniais ou caudais ? 4a e 5a esternebra no osso esterno pode reduzir riscos de perfura??o card?aca, diminuindo a taxa de mortalidade caso ocorra perfura??o tor?cica. A maior facilidade de penetra??o da agulha no esterno dos animais jovens em rela??o aos animais mais velhos observada neste estudo, j? havia sido relatada por Barreira et al. (2008b). Os diferentes est?gios e per?odos de mineraliza??o ?ssea das estruturas compactas e esponjosas desses ossos nos animais parece ser a justificativa para tal ocorr?ncia. A localiza??o aproximada de 5 cm caudal ao processo olecrano, que compreende a parte proximal e caudal da ulna, descrita por Ribeiro (2009), como refer?ncia para pun??o de MO no esterno de equinos, foi confirmada neste estudo como boa aproxima??o do ponto de pun??o entre a 4? e 5? esternebra. No entanto, ? 51 importante a manuten??o da correta posi??o anat?mica dos animais em esta??o para que a localiza??o aproximada possa ser utilizada. A quantidade de MO a ser aspirada fixada entre 20 e 25 mL, foi facilmente obtida em todas as amostras. Ribeiro (2009) obteve uma m?dia de 31,2 mL de aspirado, sendo que o maior volume foi 40 mL e o menor de 15 mL, Alves et al. (2009) obtiveram de 10 a 12 mL e Barreira et al. (2008) obtiveram de 0,5 a 5 mL. Apenas neste ?ltimo estudo foi averiguada a origem de MO das amostras microscopicamente, e somente em duas das cinco amostras esta origem foi confirmada. A diferen?a de volumes obtidos pode ser explicada pelo local da coleta no esterno, material utilizado e treinamento da t?cnica de coleta. A lavagem da seringa com solu??o heparinizada (5.000 UI/mL) e a inje??o de 10 mL dessa solu??o na cavidade medular, n?o utilizada por outros autores, facilitou a coleta e diminuiu a forma??o de agregados celulares e a consist?ncia gelatinosa da amostra, caracterizadas como poss?veis complica??es durante a coleta por Alves et al. (2009). Oliveira et al. (2010) tamb?m haviam relatado a dificuldade de colheita de MO em c?es, quando utilizada heparina apenas dentro da seringa de coleta sem injet?-la na cavidade medular. A inje??o de heparina na cavidade medular foi um procedimento indicado por Fortier (Comunica??o pessoal) em apresenta??o no congresso da World Equine Veterinary Association e mostrou-se seguro para o animal. O m?todo de isolamento utilizando o gradiente de densidade Ficoll-Hypaque tem sido descrito por diversos autores (FORTIER et al., 1998; HEGEWALD et al., 2004; PERIN et al., 2003; BARREIRA, 2005; VAZ, 2006; ALVES et al., 2009; RIBEIRO, 2009; OLIVEIRA et al., 2010) apresentando valores de c?lulas nucleadas satisfat?rios na maioria dos casos. Coincidindo com o observado por Vaz (2006), em amostras de MO de coelhos, esse m?todo aplicado em equinos resultou em concentra??o de c?lulas nucleadas, sem destrui??o celular significativa. A celularidade m?dia obtida foi bastante superior ? encontrada por Vidal et al. (2007) (6,4x106) tamb?m em equinos e por Oliveira (2008) (6,25x106) em coelhos, por?m foi semelhante ? encontrada por Vaz (2006) (8,0x107) em coelhos, e inferior ? encontrada por Oliveira et al. (2010) (3,2x10?) em c?es. J? a viabilidade celular m?dia foi superior ? encontrada por Barreira (2005) (76%), semelhante ? encontrada por Alves et al. (2009) (86,9%) e inferior ? obtida por Ribeiro (2009) (95%), por Vaz 52 (2006) (96%) e por Perin et al. (2003) (96%), sendo os tr?s primeiros em equinos e os dois ?ltimos em coelhos e em humanos, respectivamente. Apesar de todos os autores utilizarem a centrifuga??o em gradiente de densidade Ficoll-Hypaque, com tempo e velocidade de centrifuga??o semelhantes, podemos observar diferentes valores de celularidade e viabilidade celular obtidos. Uma parcela dessa variabilidade nos resultados pode ser atribu?da ?s diferen?as de cada esp?cie e mesmo a varia??es individuais. Essas diferen?as demonstram a necessidade de padroniza??o da t?cnica de isolamento para cada esp?cie buscando a otimiza??o dos resultados. No estudo em tela, houve uma grande varia??o entre os valores extremos (11,2 x 107 c?lulas entre o maior e o menor valor encontrado) fato que j? havia sido demonstrado por Woster et al. (2000) que tamb?m trabalhou com volumes fixos de aspirado de MO de equinos. A raz?o para essa variabilidade ainda ? desconhecida, por?m a idade e a massa corporal podem interferir na celularidade da FCM (VIDAL et al. 2007). CONCLUS?ES A coleta de MO com equinos em esta??o e sedados mostrou ser uma t?cnica vi?vel e de baixo custo, em compara??o ? t?cnica que preconiza a anestesia geral e dec?bito dorsal dos animais. Recomenda-se o acompanhamento da introdu??o da agulha com aparelho de ultrasson, assim como o treinamento pr?vio da t?cnica pelo coletador em pe?as anat?micas, para mitigar os riscos relacionados ?s complica??es, como perfura??o de t?rax e de cora??o. Locais de pun??o no osso esterno que evitem a proximidade com o cora??o podem diminuir a chance de lacera??o card?aca e gravidade do caso. A inje??o de solu??o heparinizada para o interior da cavidade medular auxiliou na obten??o do volume de MO desejado e mostrou ser um procedimento seguro para o animal. O m?todo de isolamento de c?lulas nucleadas de MO utilizando gradiente de densidade Ficoll-Hypaque obteve resultados satisfat?rios de celularidade e viabilidade celular em equinos, e pode ser estabelecida como meio de isolamento de FCM nesta esp?cie. . Apesar da quantidade relativamente pequena de CTMs na FCM quando comparado com a cultura expandida de MO, essa ? uma t?cnica mais acess?vel para 53 utiliza??o a campo e tem demonstrado resultados promissores na repara??o de tecidos em estudos com diversas esp?cies. AGRADECIMENTOS: A toda equipe do Hospital Escola de Grandes da Universidade de Bras?lia pela valiosa ajuda nesse trabalho, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e tecnol?gico (CNPq) pelo financiamento cedido para desenvolvimento deste projeto. ? Professora Doutora Carolina Madeira Lucci pela cess?o do laborat?rio para que fossem realizados os isolamentos de FCM. REFER?NCIAS ACKERMAN, J.L.; ALDEN, J.W.. 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Avalia??o do efeito osteog?nico RESUMO A velocidade e qualidade de reparo ?sseo s?o alguns dos grandes obst?culos enfrentados por m?dicos veterin?rios na clinica cir?rgica de equinos. Terapias alternativas que possam auxiliar no processo de osteog?nese t?m sido estudadas experimentalmente e clinicamente em diversas esp?cies animais e humanos. O seguinte estudo teve como objetivo avaliar o efeito osteog?nico do enxerto percut?neo aut?logo da fra??o de c?lulas nucleadas (FCM) de medula ?ssea (MO) em falhas ?sseas experimentais no osso IV Metacarpiano por meio de an?lise subjetiva e pelos valores de densidade mineral ?ssea (DMO). Foram utilizados cinco equinos de ambos os sexos. Ap?s cinco dias da realiza??o da falha ?ssea nos dois ossos IV metacarpianos, a MO foi aspirada do osso esterno de cada equino. Do material aspirado foi isolado a FCM por meio de centrifuga??o e separa??o em gradiente de concentra??o Ficoll Hypaque. Em seguida, foi realizado o enxerto percut?neo de FCM e DMEM no membro tor?cico direito (membro tratado MT) e apenas DMEM no membro tor?cico esquerdo (membro controle MC) de cada animal. O enxerto percut?neo confirmou-se uma t?cnica pouco invasiva, de baixo custo e que pode substituir outros m?todos de transplante de c?lulas-tronco mais invasivos. Os valores da DMO foram estatisticamente superiores no MT em rela??o ao MC em seis dos onze tempos de an?lise radiogr?fica. O MT obteve grada??o de preenchimento ?sseo superior ao MC em todos animais, sendo que em um animal essa diferen?a foi observada em quatro tempos de avalia??o (animal 5), em dois animais em cinco tempos (animais 1 e 3) e em nos dois animais restantes em seis tempos (animais 2 e 4). Os resultados obtidos demonstram que a FCM estimulou o processo de osteog?nese acelerando a repara??o ?ssea e aumentando a quantidade de matriz ?ssea mineralizada. PALAVRAS-CHAVE: repara??o ?ssea, densidade ?ssea, equinos, fra??o celular mononuclear. 60 ABSTRACT [Mesenchymal stem cells from bone marrow in IV metacarpal bone repair in horses. II. Evaluation of osteogenic effect.] The speed and quality of bone repair are major obstacles faced by veterinarians in clinical surgery of equines. Alternative therapies that can assist the process of osteogenesis have been studied experimentally and clinically in this and others species and humans. The following study aimed to evaluate the osteogenic effect of percutaneous autologous graft mononucleated cell fraction (MCF) from bone marrow (BM) in experimental bone defects in IV metacarpal bone by means of densitometry analysis and the subjective values of bone filling by radiographic (BMD). We used five horses that underwent surgery, where 1cm defects were created in both IV metacarpal bones. Five days after the surgery the BM was aspirated from the sternum of each horse. The MCF was isolated by centrifugation and separation on Ficoll Hypaque gradient of concentration. Then the graft was performed percutaneously. We injected MCF+DMEM on the right side (treated limb-TL) and only DMEM on the left (control limb-CL) of each animal. The graft percutaneous confirmed to be a minimally invasive technique low cost, that can replace other methods of transplantation of stem cells more invasive. The BMD values were significantly higher in MT compared to the MC in six of the eleven times radiographic analysis. The obtained MT grading bone fill were better than the MC in all animals, and in an animal such difference was observed in four times of assessment (animal 5), five times in two animals (animals 1 and 3) and in two animals remaining six days (animals 2 and 4). The results show FCM stimulated osteogenesis and accelerated bone repair and increasead the number of mineralized bone matrix. KEYWORDS: bone repair, bone density, equine, mononuclear cell fraction. INTRODU??O Segundo Einhorn (1998), a consolida??o de uma fratura compreende um complexo mecanismo reparador que resulta na restaura??o quase completa da arquitetura ?ssea normal, ao contr?rio de outros tecidos, que cicatrizam com a forma??o de tecidos reparadores pouco organizados. Em um ambiente favor?vel biologicamente e mecanicamente, as c?lulas- tronco mesenquimais (CTMs) proliferar?o e diferenciar?o em osteoblastos e 61 condroblastos (CARTER et al., 1998). Essas c?lulas produzir?o matriz com forma??o de oste?ide e cartilagem dando origem ao calo. O oste?ide mineralizado e a cartilagem celular sofrer?o processo de ossifica??o endocondral formando osso at? o completo preenchimento da les?o. As CTMs tamb?m s?o precursoras dos principais eventos celulares envolvidos nesse processo: quimiotaxia, migra??o, prolifera??o e diferencia??o celular (KRAUS; KIRKER-HEAD, 2006). Para a forma??o ?ssea ? necess?ria a integra??o de fatores celulares, humorais e mec?nicos. As CTMs s?o a base primordial para forma??o e repara??o ?ssea, respondendo e produzindo citocinas regenerativas, replicando e diferenciando-se para forma??o matriz estrutural e respondendo as solicita??es mec?nicas necess?rias para restaurar e manter as fun??es do esqueleto. O papel das CTMs na regenera??o ?ssea ainda est? sendo melhor definido e a manipula??o desse grupo celular tem resultado em novas estrat?gias para regenera??o ?ssea (CAPLAN; BRUDER, 2001; KHAN et al., 2005). Quando expandida in vitro as CTMs podem ser induzidas a se diferenciar em diversos tecidos. Para diferencia??o osteog?nica ? utilizado o acido asc?rbico, que ? importante para a express?o de col?geno, o glicerofosfato como uma fonte de fosfato durante a mineraliza??o, e a dexametasona para regular o processo de diferencia??o celular. Tamb?m s?o utilizados o horm?nio da paratire?ide (PTH), a prote?na ?ssea morfogen?tica (AICHER et al 2011), a prostaglandina E2, o fosfato glicerol e uma fam?lia de compostos da estatina (ZHANG, 2011). Estudos in vivo tem documentado o potencial osteog?nico das CTMs em isolados de fra??o de c?lulas mononucleadas (FCM) e ap?s expans?o das CTMs em cultivo celular. Adicionalmente, as CTMs podem manter sua viabilidade e seu potencial de diferencia??o em v?rias linhagens ap?s criopreserva??o, aumentando assim sua viabilidade para utiliza??o terap?utica (BRUDER et al., 1997). Hoje, a principal fonte para o isolamento CTMs em mam?feros ? a medula ?ssea (MO) (AICHER et al., 2011). A MO cont?m c?lulas osteoprogenitoras que podem ser obtidas por pun??o aspirativa, o que a torna um efetivo enxerto ?sseo por si s? ou um potencializador da a??o osteog?nica quando combinada com outros materiais, como enxertos ?sseos esponjosos ou corticais e de matriz ?ssea desmineralizada. A medula pode ser concentrada por centrifuga??o, e sua aplica??o via percut?nea ? um m?todo 62 simples, com m?nimo trauma aos tecidos, e que reduz o risco de infec??o e interfer?ncia na repara??o ?ssea, pela n?o introdu??o de tecido desvitalizado. O poder osteog?nico da medula ?ssea deve-se ?s c?lulas osteoprogenitoras do estroma, que cont?m dois tipos celulares: as c?lulas precursoras ?sseas determinadas e as c?lulas precursoras ?sseas indut?veis, que na presen?a de fator de indu??o local expressam atividade osteog?nica em fraturas e enxertos ?sseos (DEL CARLO et al., 2004). O uso da FCM para o tratamento de les?es ortop?dicas apresenta algumas vantagens em rela??o ? terapia com CTMs ap?s cultivo celular, como de poder ser utilizada logo ap?s o diagn?stico da les?o e com menor custo e tempo de preparo (ALVES et al., 2009). ? uma t?cnica que tamb?m n?o precisa de umo per?odo de cultura celular no laborat?rio, ? completamente aut?gena, e oferece todos os tr?s componentes importantes para a regenera??o ?ssea: c?lulas, fatores de crescimento e um suporte estrutural osteocondutor. Fortier (2010) avaliou a FCM de MO por citometria de fluxo, e encontrou aproximadamente 15 % de CTMs na FCM de MO de equinos. Tamb?m foi poss?vel notar que no centrifugado cont?m um grande n?mero de plaquetas que s?o reservat?rios naturais do corpo de v?rios fatores de crescimento, tais como IGF-I, TGF-B, FGF. Estes s?o conhecidos por aumentar a s?ntese da matriz da cartilagem, osso e tend?o. A t?cnica de inje??o de FCM de MO via percut?nea ? relativamente simples, de custo moderado e minimiza as complica??es advindas da imobiliza??o prolongada do membro (CONNOLLY et al., 1989; CONNOLLY, 1995). Segundo Garg et al. (1993), esse procedimento causa trauma m?nimo, evita intercorr?ncias no s?tio receptor e pode ser repetido facilmente. O momento ideal para a realiza??o do enxerto ainda n?o est? bem estabelecido. Paley et al. (1986) conclu?ram que a enxertia percut?nea de MO n?o deve ser realizada no dia da interven??o cir?rgica. Sharma et al. (1992), igualmente, recomendaram o realiza??o do enxerto ap?s 5 dias da les?o. Em outro estudo, Conolly (1995) constatou que o momento ideal para inje??o percut?nea deve ser ap?s a redu??o da inflama??o inicial e do per?odo de reabsor??o osteocl?stica, que ocorreu entre 6 a 12 semanas, em humanos. V?rios estudos t?m demonstrado que o enxerto percut?neo de MO integral ou de FCM de MO tem diminu?do o tempo de repara??o ?ssea (BARROS et al., 2001a,b; DEL CARLO et al., 2007; DALLARI et al., 2007; CROVACE et al., 2008; 63 OLIVEIRA et al. 2010). Barros et al. (2001a,b) realizaram a aplica??o alog?nica de FCM, por via percut?nea, em falhas ?sseas induzidas experimentalmente em r?dio de coelhos e puderam concluir que a aplica??o de FCM resultou em preenchimento precoce com forma??o direta de tecido ?sseo, quando comparado com o grupo controle, sobretudo nas duas primeiras semanas de avalia??o. Crovace et al. (2008), Del Carlo et al. (2007) e Dallari et al. (2007) utilizaram MO aut?genas, em falhas ?sseas cr?ticas em modelos experimentais animais, visando precocidade de osteog?nese, e obtiveram resultados similares a Barros et al. (2001b). Yamasaki et al.(2008) realizaram osteotomia rotacional transtrocant?rica seguida da aplica??o aut?gena de FCM associadas ? hidroxiapatita no tratamento de osteonecrose bilateral da cabe?a femoral e conclu?ram que a aplica??o das c?lulas favoreceu a repara??o ?ssea. De forma similar, Paez et al. (2007) associaram FCM ao substituto ?sseo coral Porites astreoides e constataram sustenta??o para crescimento e forma??o ?ssea precoce. Da mesma forma, Oliveira et al. (2010) avaliaram a utiliza??o de esponja de gelatina embebida em FCM isoladamente e FCM associada a prote?na ?ssea morfogen?tica na cicatraza??o de defeito ?sseo experimental na t?bia de c?es. Em ambos os casos observando crescimento ?sseo acelerado, sendo uma alternativa favor?vel ao crescimento ?sseo em defeitos agudos experimentais em t?bias de c?es. A terapia com FCM na repara??o ?ssea tem sido estudada em diversas esp?cies, por?m at? o momento n?o existem estudos que relatem sua utiliza??o em equinos. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo a an?lise do efeito osteog?nico do enxerto de FCM de MO em falhas ?sseas experimentais no osso IV MTC de equinos, por meio da compara??o dos valores m?dios de DMO e da classifica??o subjetiva do preenchimento ?sseo radiogr?fico das falhas do MT e MC. MATERIAIS E M?TODOS O experimento foi realizado no Hospital-Escola de Grandes Animais da FAV/UnB em parceria com o Laborat?rio de Reprodu??o e Biotecnologia (CFS IB/UNB). Foram utilizados cinco equinos SRD provenientes do Setor de Apreens?o da SEAGRI-DF, com peso m?dio de 248 Kg e idade aproximada variando de 2,5 a 64 10 anos provenientes do Setor de Apreens?o da Secretaria de Agricultura, Pecu?ria e Abastecimento do Distrito Federal (SEAPA/DF). Os animais foram submetidos a exame cl?nico, hemograma e bioqu?mica s?rica, comprovando assim, seu estado de higidez pr?vio ao experimento. Este trabalho foi submetido e aprovado pelo Comit? de ?tica no Uso Animal da Universidade de Bras?lia (CEUA-UnB), sob processo UnBDOC n? 48461/2010, por estar de acordo com os princ?pios ?ticos do Col?gio Brasileiro de Experimenta??o Animal (COBEA). Para o procedimento cir?rgico e realiza??o das falhas ?sseas, os animais foram submetidos a jejum alimentar e h?drico de 12 horas e tricotomia dos membros tor?cicos distalmente aos ossos do carpo. Em seguida os animais foram anestesiados, utilizando-se como medica??o pr?-anest?sica xilazina 10% (1,0mg/kg/IV), o relaxante muscular ?ter gliceril guaiacol (110mg/kg/IV) e, por fim, o cloridrato de cetamina (2,0 mg/kg/IV), como indutor anest?sico. Os animais foram entubados com sonda orotraqueal e mantidos sob anestesia geral inalat?ria com isoflurano vaporizado em oxig?nio (15mL/kg), em circuito semifechado. Como antibioticoprofilaxia, administrou-se penicilina pot?ssica, na dose de 20.000 UI/Kg, por via intravenosa, imediatamente antes do procedimento cir?rgico. Os animais foram acomodados em mesa cir?rgica, primeiramente em dec?bito lateral direito. Realizou-se a anti-sepsia do campo cir?rgico com polivinil pirrolidona degermante a 2%, polivinil pirrolidona iodo t?pico a 1% e ?lcool 70%. O acesso ao osso IV metacarpiano (IV MTC) esquerdo foi realizado por meio de incis?o linear pr?ximo-distal de pele no ter?o proximal do osso IV MTC. Ap?s divuls?o do tecido subcut?neo e localiza??o do osso IV MTC foi feita uma falha ?ssea total de um cent?metro de comprimento utilizando-se cinzel e martelo ortop?dico (Figura 4). Posteriormente foi realizada aproxima??o do tecido subcut?neo com sutura intrad?rmica utilizando fio absorv?vel poliglactina 2-0, e a sutura de pele com ponto simples separado utilizando mononylon 0, seguido de limpeza com polivinil pirrolidona iodo t?pico a 1% e bandagem compressiva com algod?o e atadura el?stica. O animal foi ent?o colocado em dec?bito lateral esquerdo e o procedimento repetido no membro direito. 65 Figura 4. Falha ?ssea de um cent?metro no osso IV MTC no momento da cirurgia (seta) Na conduta p?s-operat?ria, foram realizados curativos di?rios sobre as feridas com polivinil pirrolidona iodo 1%. Os animais permaneceram em baias individuais e receberam antibioticoterapia sist?mica com penicilina benzatina, 40.000UI/kg/IM em tr?s aplica??es, a cada 48 horas e analg?sico antiinflamat?rio a base de fenilbutazona, 4,4mg/kg/IV uma vez ao dia, por cinco dias consecutivos. A coleta de MO foi realizada cinco dias ap?s a realiza??o da falha ?ssea. O local de escolha para obten??o da amostra medular foi o osso esterno de cada equino. Durante a coleta, os animais foram mantidos em esta??o e contidos em bretes. Realizou-se tricotomia de uma ?rea de aproximadamente 5 x 20cm na regi?o do esterno. Foi realizado exame ultra-sonogr?fico afim de se localizar o local ideal 66 para pun??o, entre a 4? e a 5? estern?bras. Os animais foram sedados com detomidina (40mcg/Kg), e em seguida, procedeu-se a anestesia local com 5 mL lidoca?na no ponto da coleta. A agulha de pun??o de MO utilizada foi a do modelo Jamshidi de calibre 8G e 12 cm de comprimento, e esta foi sempre previamente lavada com solu??o heparinizada (5000UI/10mL) para evitar a forma??o de co?gulos no trajeto da agulha durante o procedimento. Ap?s incis?o de pele e musculatura, a agulha de pun??o de MO foi introduzida no sentido ventro-dorsal perpendicular ? pele. Uma vez bem fixa a agulha na cavidade medular do esterno, retirou-se o mandril, e foi feita a tentativa de aspira??o. No momento em que se conseguiu aspirar algum conte?do da MO foram injetados 10 mL de solu??o heparinizada (5000UI/10mL), com o objetivo de evitar a forma??o de co?gulos dentro da cavidade medular. Ap?s trinta segundos iniciou-se a aspira??o de cerca de 20 mL de MO com aux?lio de uma seringa de 60mL. Parte da primeira al?quota foi expelida em l?mina de microscopia para a verifica??o a olho nu da presen?a de esp?culas ?sseas e gl?bulos de gordura, sugerindo a origem medular da amostra. Para cada amostra obtida foram feitos esfrega?os, do tipo squash, que posteriormente foram corados pelo m?todo Romanowsky e avaliados em microsc?pio ?ptico, quanto ? presen?a de precursores hematopoi?ticos. A presen?a destes precurssores confirma a origem medular, enquanto a predomin?ncia de hem?cias e c?lulas maduras indica tratar-se de amostra de sangue perif?rico. Foi coletado um total de 20 a 25 mL de aspirado de MO em cada animal. As amostras foram identificadas, acondicionadas em gelo e encaminhadas ao laborat?rio, onde a fra??o de c?lulas mononucleares (FCM) da MO foi isolada . O isolamento da FCM ocorreu no interior de uma capela de fluxo laminar previamente desinfetada com ?lcool 70% e luz ultravioleta. A amostra foi dilu?da em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) na propor??o de 1:1, em seguida foi cuidadosamente depositada sobre Ficoll-Hypaque (? = 1.077 g/mL) na propor??o de 2:1. A amostra foi ent?o centrifugada a 500g por 30min com o objetivo de realizar a separa??o de seus constituintes por gradiente de concentra??o. Ap?s centrifuga??o, observou-se a separa??o das c?lulas mononucleares da MO, vis?veis na forma de um halo esbranqui?ado em suspens?o, localizado entre o plasma e a por??o contendo erit?citos com Ficoll-Hypaque. Essa camada em suspens?o foi cuidadosamente retirada por meio de pipeta autom?tica e submetida a dois 67 processos de lavagem com DMEM com o objetivo de retirar o Ficoll-Hypaque que ainda estivesse na amostra. Cada lavagem foi conduzida diluindo novamente o conte?do obtido em DMEM na propor??o de 1:1 e centrifugando a 500g por 10min. Ao t?rmino das lavagens, foi obtido na por??o final do tubo, um pellet contendo a FCM da MO. Este pellet foi, ent?o, resuspendido em DMEM at? o volume total de um mL. Utilizando uma pipeta autom?tica, retirou-se uma al?quota de 50?L da amostra para quantifica??o de c?lulas nucleadas e para o teste de viabilidade celular utilizando o corante Azul de Trypan 1% em C?mara de Neubauer. O estudo da celularidade e da viabilidade celular foi realizado em microsc?pio ?ptico, fazendo-se a contagem de c?lulas mortas coradas e c?lulas vivas n?o coradas. Para o c?lculo do n?mero aproximado de CTMs foi utilizada a estimativa de uma dessas c?lulas para cada 100.000 c?lulas nucleadas (CONOLLY, 1995). Para o enxerto percut?neo padronizou-se a quantidade de 5x107 c?lulas nucleadas, e o volume de um mL. A amostra foi mantida em eppendorf em 8?C at? o momento da realiza??o do enxerto. Para o enxerto percut?neo no local das falhas ?sseas, os animais foram contidos em bretes e sedados com xilazina 10% (0,5mg/kg). Foi, ent?o, introduzida uma agulha hipod?rmica 0,80 x 30 mm no local da falha ?ssea, e em seguida, realizadas radiografias convencionais na proje??o dorsolateral-palmaromedial para confirma??o do correto posicionamento da agulha (Figura 5-B). No membro tor?cico direito (Membro Tratado MT), cada animal recebeu 01 mL da solu??o de FCM dilu?da em DMEM e no membro tor?cico esquerdo (Membro Controle MC) recebeu 01 mL apenas de DMEM. Em caso de presen?a de seroma no local da falha ?ssea, foi conduzida a pun??o e drenagem do seroma acumulado antes da realiza??o do enxerto. Os exames radiogr?ficos para an?lise da regenera??o ?ssea local foram realizados por meio de radiografias convencionais, obtidas pela proje??o dordolateral-palmaromedial obliqua 45?, realizados no D7 (sete dias ap?s o enxerto percut?neo), semanalmente at? o D56 e a cada 28 dias at? o dia 140. As radiografias foram utilizadas para avalia??o DMO e classifica??o subjetiva de cinco especialistas quanto ao grau de preenchimento ?sseo em uma escala composta por seis graus de preenchimento ?sseo. 68 Figura 5. A- Agulha posicionada no local do enxerto percut?neo (seta) no momento da realiza??o da radiografia para confirma??o do correto posicionamento da agulha. B- Radiografia na proje??o dorsolateral-palmaromedial mostrando a correta localiza??o da agulha para enxerto percut?neo na falha ?ssea. Aparelho de raios-x port?til (Poskom PXP-40HF; Poskom Co.; Cor?ia do Sul) e filme radiogr?fico de tamanho 24 x 30 cm foram empregados para os exames radiogr?ficos. O chassi, contendo filme, foi inserido em um porta chassi confeccionado em madeira compensada com espessura de 3mm, no qual se fixou uma escala de alum?nio (penetr?metro) composta por 29 degraus. O primeiro degrau tinha altura de 1mm, variando em seguida de 1 em 1mm at? o vig?simo nono, tolerando-se uma varia??o m?xima de 0,03mm na espessura de cada degrau, tendo a superf?cie de cada um ?rea de 5 x 15 mm. O penetr?metro foi colocado de forma que os degraus estivessem pr?ximos e paralelos ao osso metacarpiano acess?rio a ser visualizado (Figura 5-A). O fator de exposi??o empregado foi de 62 kVp e 1,00 a 1,20 mAs, incidindo-se o feixe principal entre o ponto em que deveria ser A B 69 posicionado o osso metacarpiano acess?rio e a escala de alum?nio, objetivando-se igual quantidade e intensidade de radia??o em ambas as estruturas. A dist?ncia foco-filme foi mantida em 70cm. O fator de exposi??o empregado permitiu uma boa visualiza??o do osso metacarpiano acess?rio, ficando as demais estruturas, mais espessas, subexpostas. Ap?s processamento manual das radiografias, as imagens radiogr?ficas foram digitalizadas com o uso de scanner e adaptador para transfer?ncias. Por meio do software Adobe Photoshop CS5 Extended as imagens do osso metacarpiano acess?rio foram analisadas de acordo com m?todo validado por Dezotti (2000). A imagem a ser analisada foi aberta no programa e no item ferramenta foi escolhida a imagem retangular. Em seguida, foi fixado um tamanho de 10 pixels de altura por 20 pixels de largura para este ret?ngulo. Este ret?ngulo criado foi arrastado em cima da ?rea do ter?o m?dio do osso metacarpiano acess?rio que estava sendo analisado. Com a ferramenta histograma foi poss?vel medir a Densidade Radiogr?fica (m?dia e desvio padr?o) da ?rea marcada pelo ret?ngulo, em tons de cinza (Figura 6). Em seguida a forma retangular foi movida para o degrau correspondente a 10 mm de alum?nio (10? degrau) e foi medida a Densidade Radiogr?fica (m?dia e desvio padr?o) correspondente a 10 mm de alum?nio (mmAl). A densidade da ?rea ?ssea em mmAl foi calculada por regra de tr?s simples. Os resultados de DMO obtidos foram avaliados estatisticamente atrav?s da m?dia e desvio padr?o e seus IC de 95% para cada grupo em cada tempo de avalia??o e estes resultados foram confrontados pelo teste T-student. Apenas aqueles que apresentaram um p< 0,05 foram considerados estatisticamente diferentes. A determina??o subjetiva do grau de preenchimento ?sseo foi realizada a partir da an?lise da extens?o do preenchimento e da radiopacidade da falha ?ssea nas radiografias, assim como outras altera??es radiogr?ficas encontradas. Os seis graus de preenchimento ?sseo foram divididos da seguinte maneira: preenchimento ausente (grau 0), discretamente preenchido at? 25% da falha (grau 1), de discreto a moderadamente preenchido ? de 26% a 50% da falha (grau 2), moderadamente preenchido ? de 51% a 75% da falha (grau 3), de moderado a totalmente preenchido- 76 a 99% da falha (grau 4), totalmente preenchido (grau 5). 70 Figura 6. Demonstra??o da tela do programa Adobe Photoshop CS5, que mostra a densidade radiogr?fica da ?rea marcada pelo ret?ngulo (flecha vermelha) em n?veis de cinza, a m?dia, o desvio padr?o e a mediana, bem como o histograma. (A) Mensura??o da densidade mineral na regi?o do defeito ?sseo. (B) Mensura??o da densidade mineral na escala de 10 mmAl. A B 71 RESULTADOS A falha ?ssea foi pass?vel de ser realizada com martelo ortop?dico e cinzel. Ap?s recupera??o anest?sica os animais n?o apresentaram claudica??o que pudesse ser notada ao passo. O enxerto percut?neo na falha ?ssea mostrou-se um procedimento pouco invasivo e de simples realiza??o, sendo poss?vel de ser conduzido sem necessidade de anestesia geral e interven??o cir?rgica. N?o foi observado sinais de infec??o ou rea??o inflamat?ria ap?s enxerto. Em tr?s animais foi necess?rio o reposicionamento na agulha utilizada para o enxerto, pois ap?s a realiza??o da radiografia foi observado que a mesma n?o se encontrava na posi??o ideal. O ?nico inconveniente encontrado na realiza??o do enxerto foi o refluxo de uma pequena fra??o do conte?do implantado pelo trajeto da agulha devido ? press?o interna secund?ria ao edema na regi?o da falha ?ssea. A quantidade do refluxo variou de diretamente acordo com a extens?o do edema, quantidade de seroma presente e quantidade de seroma drenado antes da aplica??o, n?o a excedendo aproximadamente um quinto da amostra. A quantidade de c?lulas mononucleadas a ser enxertada, inicialmente proposta de 5x107, n?o foi alcan?ada em tr?s animais. Dessa forma, foi realizado o enxerto com o n?mero total de c?lulas nucleadas obtidas nesses animais. Os n?meros de c?lulas nucleadas obtidas em cada animal est?o expressos na Tabela 1. Tabela 1. Contagem de c?lulas da fra??o mononuclear (FCM) obtidas em 20 mL de medula ?ssea, quantidade de c?lulas-tronco mesenquimais presentes na FCM (valor calculado) e viabilidade de c?lulas da FCM. Animal Idade (anos) Quantidade de c?lulas da FCM da medula ?ssea C?lulas-tronco mesenquimais (valor calculado) Viabilidade celular da FCM (% de c?lulas vivas) 01 2,5 14,0 x 10? 1400 88% 02 3,5 10,2 x 10? 1020 94% 03 10 4,1 x 10? 410 94% 04 8 4,4 x 10? 440 73% 05 3,5 2,8 x 10? 280 82% M?dia 5,5 7,1 x 10? 710 86,2%. 72 Os graus de preenchimento ?sseo obtidos pela an?lise subjetiva das radiografias dos MT e MC nos diferentes tempos de avalia??o radiogr?fica est?o descritos no tabela 2. A figura 4 demonstra as radiografias dos MT e o MC do animal 1 nos diferentes tempos de avalia??o radiogr?fica. Tabela 2. Graus de regenera??o ?ssea obtidos pela an?lise subjetiva do MT e MC nos diferentes tempos de avalia??o. Os valores dos graus foram obtidos utilizando a moda dos graus determinados por cinco avaliadores. * Tempos onde o MT obteve grada??o superior que o MC. DIA ANIMAL 1 ANIMAL 2 ANIMAL 3 ANIMAL 4 ANIMAL 5 MT MC MT MC MT MC MT MC MT MC 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 7 0 0 1* 0* 0 0 1* 0* 1* 0 14 0 0 1* 0* 0 0 1* 0* 1 1 21 1* 0* 1* 0* 0 0 1* 0* 1 1 28 1* 0* 1* 0* 1* 0* 1* 0* 1 1 35 1 1 1* 0* 1 1 1* 0* 1 1 42 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 49 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 56 1 1 1 1 2* 1 1 1 1 1 84 2* 1* 1 1 2* 1* 2 2 2* 1* 112 2* 1* 1 1 2* 1* 3 3 2* 1* 140 2* 1* 2* 1* 2* 1* 4* 3* 2* 1* 73 Figura 7. Imagens radiogr?ficas do MT e MC do animal 1 nos diferentes tempos de an?lise radiogr?fica. N?o foi observada a forma??o de osso na ?rea adjacente ? regi?o da falha e nos tecidos moles adjacentes de nenhum animal. Nos Membros tratado houve forma??o de osso nas extremidades do IV MTC, por?m tamb?m foi observado forma??o de osso no centro da falha ?ssea, o que n?o foi observado nos Membros Controle. Na an?lise da DMO foram encontradas diferen?as significativas entre os valores m?dios de DMO dos membros tratado e Membros controle em seis dos onze dias em que foram realizadas as radiografias. Os valores de DMO dos dois grupos nos diferentes tempos de avalia??o est?o apresentados na Tabela 3 e figura 8. 74 Tabela 3. Valores m?dios da densidade mineral ?ssea (DMO) em mil?metros de alum?nio (mm/Al) no membro tratado (MT) e membro controle (MC) nos diferentes tempos de an?lise radiogr?fica. *Tempos onde houve diferen?a estat?stica significativa entre MT e MC pelo teste t-student (considerando os intervalos de confian?a de 95%). DIA Membro tratamento Membro controle 7 8,97 7,17 14 9,01 8,79 21 8,36 8,99 28 9,44 7,85 35 9,09* 6,07* 42 8,93* 7,00* 49 8,98* 6,91* 56 7,50* 6,72* 84 9,73 8,63 112 10,01* 7,96* 140 10,99* 7,89* Figura 8. Valores m?dios da densidade mineral ?ssea (DMO) em mil?metros de alum?nio (mm/Al) no membro tratado (MT) e membro controle (MC) nos diferentes tempos de an?lise radiogr?fica. 0 2 4 6 8 10 12 MT (mmAl) MC (mmAl) 75 DISCUSS?O Coincidindo com o descrito por Connolly et al. (1989), Connolly (1995), Garg et al. (1993) e Barros et al. (2001a), o enxerto percut?neo na falha ?ssea mostrou-se um procedimento minimamente invasivo e de simples realiza??o, sendo pass?vel de ser conduzido sem necessidade de anestesia geral e interven??o cir?rgica, apresentando assim in?meras vantagens em rela??o a outros m?todos cir?rgicos mais comumente utilizados. Embora estes autores tenham conduzidos seus estudos em outras esp?cies animais, os achados deste trabalho em equinos corroboraram com o descrito na literatura. A aplica??o do enxerto de FCM cinco dias ap?s a realiza??o da falha ?ssea, conforme Barros et al. (2001a,b), propiciou a visualiza??o de resultados estatisticamentes diferentes entre o MT e o MC em 6 dos 11 tempos de avalia??o, no entanto apresentou um inconveniente. Na regi?o do implante ainda havia edema e seroma p?s-operat?rio, tornando a inje??o de FCM um pouco mais dificultosa. Dessa forma, ? recomendado que se espere a completa resolu??o inflamat?ria antes da realiza??o do enxerto, observando que esse tempo pode variar de acordo com a les?o a ser tratada. Outro aspecto relevante a ser considerado nesta t?cnica, que pode diminuir os problemas relacionados ? complica??o de refluxo do enxerto, ? a utiliza??o de trombina conforme descrito por Fortier (2010). Ao se acrescentar a trombina na FCM ocorre ativa??o e desgranula??o das plaquetas presentes na FCM, o que al?m de aumentar a libera??o de fatores de crescimento pelas plaquetas aumenta a viscosidade da FCM formando, portanto, uma estrutura que pode funcionar como um material osteocondutor e que dificultaria o refluxo da amostra ap?s a retirada da agulha utilizada para o enxerto. Sugere-se tamb?m que a utiliza??o de um ligante pepitideomim?tico espec?fico de alta afinidade para osso (LLP2A) pode potencializar o efeito terap?utico com FCM, como descrito por Guan et al. (2012). Estes autores usaram este ligante associado a CTMs em ratos osteop?nicos com falhas ?sseas e conseguiram um melhor direcionamento das CTMs para a superf?cie do osso e um aumento significante da forma??o de osso trabecular e massa ?ssea ap?s uma ?nica inje??o intravenosa do composto terap?utico. 76 Corroborando com Barros et al. (2001b), no MT foi poss?vel observar forma??o de osso, evidenciada pela radiopacidade, no centro da falha ?ssea, fato que n?o ocorreu no MC. Tamb?m foi poss?vel observar que o animal no qual a diferen?a de preenchimento ?sseo entre o MT e o MC foi encontrada apenas em quatro tempos de avalia??o foi o que obteve a celularidade mais baixa (2,8x107). Esses dados sustentam a id?ia que as CTMs presentes na FCM de MO se diferenciaram em tecido ?sseo e sugerem que a quantidade de c?lulas mononucleadas de MO e de CTMs implantada influencia diretamente a velocidade do processo de repara??o ?ssea. Alguns autores relatam que a quantidade de CTMs (BONYADI, et al., 2003; STOLZING et al., 2008; GUAN et al., 2012) e fatores de crescimento (GAO et al., 2012) na MO diminui de acordo com a idade e que o potencial osteog?nico da terapia com FCMs de animais mais velhos poderia ser reduzido. Por?m, nesse estudo n?o foi observado essa rela??o, pois o animal com maior idade no grupo (Animal 5) obteve grada??o de preenchimento ?sseo superior no MT em cinco tempos de avalia??o (tabela 1 e 2), n?o sendo, assim, o que apresentou pior resultado. Os resultados da presente pesquisa suportam o conceito de que a osteog?nese ? estimulada pelo enxerto percut?neo de FCM medula ?ssea que este est?mulo est? relacionado ? presen?a de c?lulas osteoprogenitoras, ? semelhan?a do que foi descrito por Urist et al.(1979), Takagi e Urist (1982), Salama (1983), Burwell (1985), Healey et al. (1990), Connolly et al. (1991), Barros et al. (2001 a,b). Al?m disso, a aplica??o de FCM de MO resultou em preenchimento precoce, quando comparado com o controle. Os resultados auferidos indicam que a FCM de MO possui suficiente capacidade osteog?nica para forma??o ?ssea. Essa propriedade de diferencia??o em c?lulas ?sseas pode ter sido favorecida pela presen?a de fatores de crescimento, liberados durante o processo inflamat?rio, no quinto dia p?s-cir?rgico. A exist?ncia desses fatores foi importante na repara??o, como citado por Reddi (1995). Ainda, segundo Werntz et al. (1996), em situa??es cr?nicas, o potencial osteog?nico da medula n?o ? dependente de um agente osteoindutor, mas pode ser favorecido pela sua presen?a 77 O n?mero de CTMs implantadas parece ter influenciado no processo de repara??o ?ssea, portanto, com aprimoramento das t?cnicas de coleta de MO e isolamento de FCM, buscando a obten??o de um maior n?mero de c?lulas nucleadas e porcentagem de c?lulas vi?veis, ser? poss?vel obter melhores resultados de repara??o tecidual. Al?m da a??o terap?utica das CTMs, a forma??o ?ssea precoce pode ter sido influenciada pelos fatores de crescimento liberados pela desgranula??o das plaquetas presentes na FCM. Dessa forma, este procedimento pode ser utilizado tamb?m em situa??es cr?nicas para iniciar ou reiniciar o processo de repara??o, como no caso de uni?o tardia, n?o uni?o, m? forma??o cong?nita e ressec??o de neoplasia, segundo recomendaram Paley et al. (1986), Healey et al. (1990), Garg et al. (1993) e Garg e Gaur (1995). CONCLUS?ES Em equinos o osso IV MTC pode ser utilizado no protocolo experimental para avalia??es da repara??o ?ssea. Ap?s a falha ?ssea de um cent?metro utilizada nesse estudo, os animais n?o manifestaram sinais de dor e claudica??o ao passo. O enxerto percut?neo de FCM mostrou-se pouco invasivo, de baixo custo, podendo ser conduzido sem necessidade de anestesia geral e interven??o cir?rgica. Esta t?cnica torna-se vi?vel para utiliza??o por profissionais de campo, devido ao seu r?pido processamento e ? possibilidade de aplica??o a em curto espa?o de tempo ap?s o desenvolvimento da les?o. A terapia com FCM mostrou ser eficaz no est?mulo da osteog?nese, acelerando o processo de repara??o ?ssea e aumentando a quantidade de matriz ?ssea mineralizada, quando comparados os resultados do MT com do MC. Apesar da quantidade de CTMs na FCM ser descrita por alguns autores como pequena em rela??o ao n?mero total de c?lulas mononucleadas, a utiliza??o direta de FCM em les?es ?sseas apresenta algumas vantagens em rela??o ao implante de CTMs ap?s cultivo celular, sendo: custo e tempo de preparo reduzidos e a presen?a de fatores de crescimento liberados pelas plaquetas de degranula??o, que auxiliam no processo de repara??o e funcionam como osteoindutores para as CTMs implantadas e quimiot?xicos para CTMs presentes no tecido. Dessa forma, destaca- 78 se a utiliza??o terap?utica da FCM em processos subagudos e tamb?m cr?nicos, aonde o meio necess?rio para diferencia??o das CTMs pode n?o ser o ideal. AGRADECIMENTOS: A toda equipe do Hospital Escola de Grandes da Universidade de Brasilia pela valiosa ajuda nesse trabalho, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e tecnol?gico (CNPq) pelo financiamento cedido para desenvolvimento deste projeto. ? Professora Doutora Carolina Madeira Lucci pela cess?o do laborat?rio para que fossem realizados os isolamentos de FCM. REFER?NCIAS AICHER, W.K., et al. Regeneration of cartilage and bone by de!ned subsets of mesenchymal stromal cells - Potential and pitfalls. Advanced Drug Delivery Reviews. v. 63, p. 342?351, 2011. ALVES, A.L.G., VIEIRA, M.E.M., BARREIRA, A.P.B., et al. Protocolo de isolamento de c?lulas mononucleares de medula ?ssea de equinos. Vet. e Zootec, v. 16, p. 650-655, n.4 out., 2009. BARROS, S.V.G. et al. Auto-enxerto percut?neo de medula ?ssea. I Coleta, preparo e aplica??o. Ci?ncia Rural, v.31, p.1013-1018, 2001a. BARROS, S.V.G. et al. Auto-enxerto percut?neo de medula ?ssea. 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